overlap+pcr
答：因为Overlap PCR中间那个引物是互补的，所以第一轮的两段PCR片段可以通过那段互补序列粘在一起。把第一轮的两段PCR产物混在一起，变性退火后有三种组合：原来的两段PCR片段，混搭在一起的PCR片段，只有后面一条可以作为第二轮的模板。
答：呵呵，一定要用高保真酶的，有两点原因：第一，就是第一条回答，高保真能够保障基因扩增引起的不必要突变。（呵呵，如果你的扩增片段全长只有79bp那就无所谓了，但要参照第二条）；第二，就是高保真酶不会在扩增的末尾（即3‘端）加A，引来后续操作不必要的麻烦。~.~...
答：我的原则是引物最好控制在50以下，当然70的我也用过，但是容易在合成中出现错误，因此要在构建完成后测序验证，长度够用即可，不是越长越好。
答：几点考虑：你的A2和B1和原来模板的互补区太短了。或者说你加上的序列和互补区的比例太大了，影响PCR的反应 先试一下，看看你的A1和B2在一起P，能不能有结果
答：据我的经验如果你的目的条带没有出来，那100bp处应该是引物二聚体之类的东东，你做第二步PCR的时候先不要加上下游引物，先在比较低的退火温度下扩增10圈，然后再加引物，扩个15圈，如果你重叠部分设计的没有问题，基本上都能扩增出来。不行你就试试touchdown程序，如果还是出不来，肯定是你的引物...
答：其实就是PCR,做两次,把两段序列融合在一起,第一次PCR的时候,第一段序列的3'引物和第二段序列的5'引物要有一段互补区,然后用第一次PCR的产物做模板,第一段序列的5'引物和第二段序列的3'引物做引物,进行第二次扩增,形成融合序列,详见图示。
答：看你的要求。1楼那位同学的回答没有问题，通过在引物上设计酶切位点，做酶切、连接即可以连接两端基因。但如果你的这两段基因不好设计酶切位点，或者你不希望在这两段基因之间存在有其余的多余碱基，而且你又特别强调用PCR的方法去做连接，那么我推荐overlap-PCR。把A基因3'端的序列加到扩增B基因的...
答：把需要研究的基因称为目的基因。（一般把需要分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。所以有时有些书本上也笼统的称“用限制性核酸内切酶切割目的基因（靶基因）”）
答：没有明确规定，但我们通常使用十五六个重叠，效果还不错。
答：如何获取目的基因（DNA）。1.反向转录法。以目的基因mRNA为模板，设计上下游的引物，加入原料（dNTP），借助反转录酶，依据碱基互补配对的原则获得cDNA，再用DNA聚合酶合成双链DNA。2.人工合成首先要通过化学合成的方法合成一些寡核苷酸片段，相邻寡核苷酸片段之前包含互补的碱基；然后通过overlap PCR，使寡...
网友评论：
席是15390649561：
什么叫overlap PCR -
52148连健
：[答案] 重叠PCR,拼全了是重叠延伸PCR或splicing by overlap extension,SOE.
席是15390649561：
重叠PCR是做什么用的?具体原理是什么? -
52148连健
： overlap-PCR主要在构建载体、拼接DNA片段、制造点突变、或者人工合成DNA片段的过程中用到.具体原理你可以去查一些参考书,说的比较仔细.简单地说就是把A基因3'端的序列加到扩增B基因的上游引物5'端,把B基因5'端的序列加到扩增A基因的下游引物的3'端.分别扩增A、B两基因,这样A的3'端和B的5'端就形成了互补.切胶回收这两个PCR产物,稀释并混合,以此为模板,以A基因的上游引物和B基因的下游引物为引物对,扩增.这样就可以得到AB拼接到一起的产物.
席是15390649561：
通过PCR方法如何连接两个基因 -
52148连健
：[答案] 看你的要求. 1楼那位同学的回答没有问题,通过在引物上设计酶切位点,做酶切、连接即可以连接两端基因. 但如果你的这两段基因不好设计酶切位点,或者你不希望在这两段基因之间存在有其余的多余碱基,而且你又特别强调用PCR的方法去做连...
席是15390649561：
什么是overlap extension pcr -
52148连健
： 重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR) 由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来. 此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物. 重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计. 重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用.
席是15390649561：
何为 overlapping PCR,复式PCR -
52148连健
： overlap就是搭桥PCR~两段片段互为引物进行PCR~跟引物二聚体形成的原理差不多~
席是15390649561：
重叠PCR的原理SOE - PCR原理 -
52148连健
：[答案] 重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PC...
席是15390649561：
你好,我这两天在做overlap pcr,两个基因都p出来了,退火温度分别为a:58 b:56, -
52148连健
： 据我的经验如果你的目的条带没有出来,那100bp处应该是引物二聚体之类的东东,你做第二步PCR的时候先不要加上下游引物,先在比较低的退火温度下扩增10圈,然后再加引物,扩个15圈,如果你重叠部分设计的没有问题,基本上都能扩增出来.不行你就试试touchdown程序,如果还是出不来,肯定是你的引物哪里有问题了.
席是15390649561：
什么是overlap extension pcr -
52148连健
： 重叠延伸聚合酶链式反应,一种DNA技术.
席是15390649561：
请问,我用OVERLAP PCR 合成一小片段我要突变的79bp的基因,需要高保真酶吗? -
52148连健
： 呵呵,一定要用高保真酶的,有两点原因:第一,就是第一条回答,高保真能够保障基因扩增引起的不必要突变.(呵呵,如果你的扩增片段全长只有79bp那就无所谓了,但要参照第二条);第二,就是高保真酶不会在扩增的末尾(即3'端)加A,引来后续操作不必要的麻烦.~.~
席是15390649561：
怎样把一个片段dna分子首尾相连4次插入到噬菌体 -
52148连健
： 大概有几种方法:1. 最朴实的,就是用PCR的方法,做overlap PCR,将片段首尾相连起来,两两相连,再两两相连,连成4个串联的,就可以了.2. 在引物前后设计不同的酶切位点,PCR后酶切,然后直接连接.3. PCR出来,平末端随机连.不举例了~懒
