马铃薯原生质体如何制备、分离纯化？ 马铃薯的原生质体与番茄的原生质体为什么能融合
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马铃薯原生质体制备和拟南芥、烟草、蚕豆、小麦原生质体制备方向相似。本人对这几个材料都用过，但我感觉马铃薯、蚕豆和小麦的原生质体还是比较容易制备的，成功与否关键在于材料生长时期的正确选择。最好组织较嫩、具有适度的叶绿体。马铃薯种子在营养土中种植10天左右，用嫩的茎叶就可以做原生质体。或者在MS培养基上种植的幼苗也可以用。多做几次就掌握了，关键是自己的经验。祝你好运。1. B5培养基上萌发拟南芥种子，待根长至1-3厘米时即可移栽到土里，温室培养，光照12h/12h，150μE。
2. 准备好一个90mm培养皿，称1.82克D－甘露醇于20ml双蒸水中。培养皿的盖子用来切叶片。
3. 取4周后未抽台前的叶片，约90片。切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液中。可以一边切一边从植株上取。
4. 配酶解液，100ml三角瓶，15ml酶解体系。
5. 将步骤3中细条捞出，置于酶解液中。黑暗，23℃，40-50rpm酶解3小时。
6. 酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管（直径约1cm）中，均分为两管。4℃，60 g，15min，brake 设为4-5。
7. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。4℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
8. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。冰上放置30min。
9. 23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬。（本步骤及以下操作均在23℃。）
10. 取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤9中的原生质体。用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀。
11. 加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀。放置20-30min。
12. 加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀。23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
13. 弃上清，加100ul W5，混匀。加900ul W5，混匀。
14. 上述混合液体置于六孔板内，23℃，弱光，孵育6-18小时。
15. 荧光观察，观察之前100g，常温，离心2分钟，终体积控制在50ul左右。
Solution Recipes
Enzyme solution
1ml 15％cellulase R10 (RS is too strong)
1ml 4.5％macerozyme R10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan)
1.09 g mannitol
1ml 0.3M KCl
1ml 0.3M MES, pH 5.7
Heat the enzyme solution at 55oC for 10 min (to inactivate proteases and enhance enzymesolubility) and cool it to room temperature before adding
1ml 0.15M CaCl2
1ml 0.75mM β-mercaptoethanol
1ml 1.5% BSA
PEG solution (40%, v/v)
1 g PEG4000 (Fluka, #81240) **Very Important!!
0.75 ml H2O
0.625 ml 0.8 M mannitol
0.25 ml 1M CaCl2
W 5
1000 ml
154 mM NaCl 9.0 g
125 mM CaCl2 18.4 g
5 mM KCl 0.37 g
5 mM glucose 0.9 g
0.03% MES 0.3 g
pH to 5.8 with KOH
autoclave 20 minutes in 125 bottles
MaMg solution
100 ml
15 mM MgCl2 1.5 ml 1M MgCl2
0.1% MES 0.1 g
0.4 M mannitol 7.3 g
pH to 5.6 with KOH
autoclave 20 minutes in 125 ml bottles
References
1. Sheen, J. 2002, A transient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts. http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb/
具体？高三生物书上有。
切一块------放到无菌设施里------生长素-------细胞分裂素。。。。
就和胡萝卜的那个实验差不多，百度文库有所有步骤
用纤维素酶和果胶酶处理马铃薯细胞可以得到马铃薯原生质体
离心也可以得到
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