十万火急！！！！十万火急！！谁能告诉我GST-PULLDOWN的原理以及酵母杂交技术的原理哈？？？？？？
GST pull down \u5b9e\u9a8c\u7ec6\u8282\u95ee\u9898\u6c42\u6559\u3000\u3000GST pull-down\u5b9e\u9a8c\u662f\u4e00\u4e2a\u884c\u4e4b\u6709\u6548\u7684\u9a8c\u8bc1\u9175\u6bcd\u53cc\u6742\u4ea4\u7cfb\u7edf\u7684\u4f53\u5916\u8bd5\u9a8c\u6280\u672f,\u8fd1\u5e74\u6765\u8d8a\u6765\u8d8a\u53d7\u5230\u5e7f\u5927\u5b66\u8005\u7684\u9752\u7750\u3002\u5176\u57fa\u672c\u539f\u7406\u662f\u5c06\u9776\u86cb\u767d-GST\u878d\u5408\u86cb\u767d\u4eb2\u548c\u56fa\u5316\u5728\u8c37\u80f1\u7518\u80bd\u4eb2\u548c\u6811\u8102\u4e0a,\u4f5c\u4e3a\u4e0e\u76ee\u7684\u86cb\u767d\u4eb2\u548c\u7684\u652f\u6491\u7269,\u5145\u5f53\u4e00\u79cd\u201c\u8bf1\u9975\u86cb\u767d\u201d,\u76ee\u7684\u86cb\u767d\u6eb6\u6db2\u8fc7\u67f1,\u53ef\u4ece\u4e2d\u6355\u83b7\u4e0e\u4e4b\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u7684\u201c\u6355\u83b7\u86cb\u767d\u201d(\u76ee\u7684\u86cb\u767d),\u6d17\u8131\u7ed3\u5408\u7269\u540e\u901a\u8fc7SDS-PAGE\u7535\u6cf3\u5206\u6790,\u4ece\u800c\u8bc1\u5b9e\u4e24\u79cd\u86cb\u767d\u95f4\u7684\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u6216\u7b5b\u9009\u76f8\u5e94\u7684\u76ee\u7684\u86cb\u767d,\u201c\u8bf1\u9975\u86cb\u767d\u201d\u548c\u201c\u6355\u83b7\u86cb\u767d\u201d\u5747\u53ef\u901a\u8fc7\u7ec6\u80de\u88c2\u89e3\u7269\u3001\u7eaf\u5316\u7684\u86cb\u767d\u3001\u8868\u8fbe\u7cfb\u7edf\u4ee5\u53ca\u4f53\u5916\u8f6c\u5f55\u7ffb\u8bd1\u7cfb\u7edf\u7b49\u65b9\u6cd5\u83b7\u5f97\u3002\u6b64\u65b9\u6cd5\u7b80\u5355\u6613\u884c,\u64cd\u4f5c\u65b9\u4fbf\u3002 GST\uff1a\u8c37\u80f1\u7518\u80bd\u5def\u57fa\u8f6c\u79fb\u9176(glutathione S-transferase) \u5206\u5b50\u514b\u9686\u7b2c\u4e09\u7248\u6709\u8be6\u7ec6\u4ecb\u7ecd\uff0c\u7ed3\u5408\u5176\u4e2d\u7684\u793a\u610f\u56fe\u5f88\u5bb9\u6613\u7406\u89e3 GST\u878d\u5408\u86cb\u767d\u6c89\u964d\u6280\u672f\u5229\u7528\u4e86GST\u5bf9\u8c37\u80e7\u7518\u80a4\u5076\u8054\u7403\u73e0\u7684\u4eb2\u548c\u6027\uff0c\u4ece\u975e\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u86cb\u767d\u7684\u6eb6\u6db2\u4e2d\u7eaf\u5316\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u86cb\u767d\u3002 GST\u878d\u5408\u7684\u63a2\u9488\u86cb\u767d\u4ece\u7ec6\u83cc\u4e2d\u8868\u8fbe\u548c\u7eaf\u5316\uff0c\u5e76\u5e73\u884c\u5236\u5907\u7ec6\u80de\u88c2\u89e3\u6db2(\u53ef\u88ab35S\u6807\u8bb0\u6216\u975e\u6807\u8bb0)\uff0c\u518d\u5c06GST\u878d\u5408\u86cb\u767d\u63a2\u9488\u548c\u7ec6\u80de\u88c2\u89e3\u6db2\u5728\u8c37\u80e7\u7518\u80a4\u743c\u8102\u7cd6\u7403\u73e0\u5b58\u5728\u4e0b\u6df7\u5408\u5e76\u5b75\u80b2\uff0c\u4ee5\u4f7f\u86cb\u767d\u7ed3\u5408\u3002GST\u878d\u5408\u63a2\u9488\u86cb\u767d\u548c\u4efb\u4f55\u7ed3\u5408\u5206\u5b50\u88ab\u79bb\u5fc3\u6536\u96c6\uff0c\u83b7\u5f97\u7684\u6df7\u5408\u7269\u7ecf\u6d17\u6da4\u540e\uff0c\u7528\u8fc7\u91cf\u6e38\u79bb\u7684\u8c37\u80e7\u7518\u80a4\u6d17\u8131\u6216\u76f4\u63a5\u5728SDS-PAGE\u4e0a\u6837\u7f13\u51b2\u6db2\u4e2d\u716e\u6cb8\u3002\u86cb\u767d\u8d28\u7ecfSDS-PAGE\u5206\u79bb\u540e\u8fdb\u884c\u4e0b\u4e00\u6b65\u7684western\u5370\u8ff9\u3001\u653e\u5c04\u81ea\u663e\u5f71\u53ca\u86cb\u767d\u8d28\u67d3\u8272\u5206\u6790\u3002GST\u6c89\u964d\u6280\u672f\u5bf9\u63a2\u6d4b\u86cb\u767d\u5728\u6eb6\u6db2\u4e2d\u7684\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u7279\u522b\u6709\u7528\uff0c\u800c\u8fd9\u79cd\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u5728\u819c\u7684\u5206\u6790\u4e2d\u53ef\u80fd\u662f\u68c0\u6d4b\u4e0d\u5230\u7684\u3002 GST\u6c89\u964d\u5b9e\u9a8c\u901a\u5e38\u6709\u4e24\u79cd\u5e94\u7528:\u786e\u5b9a\u878d\u5408(\u6216\u63a2\u9488)\u86cb\u767d\u4e0e\u672a\u77e5(\u6216\u9776)\u86cb\u767d\u95f4\u65b0\u7684\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),\u4ee5\u53ca\u8bc1\u5b9e\u63a2\u9488\u86cb\u767d\u4e0e\u5df2\u77e5\u86cb\u767d\u8d28\u95f4\u53ef\u7591\u7684\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528(\u4f8b\u5b50\u8bf7\u89c1Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)\u3002\u8fd9\u4e24\u79cd\u5b9e\u9a8c\u7684\u8bbe\u8ba1\u548c\u5b9e\u65bd\u90fd\u6709\u6240\u4e0d\u540c\u3002 \u5b9e\u9a8c\u76ee\u7684\uff1a\u4f53\u5916\u68c0\u6d4b\u86cb\u767d\u8d28\u4e0e\u86cb\u767d\u8d28\u4e4b\u95f4\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u3002\u7528\u4e8e\u9a8c\u8bc1\u4e24\u4e2a\u5df2\u77e5\u86cb\u767d\u7684\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\uff0c\u6216\u8005\u7b5b\u9009\u4e0e\u5df2\u77e5\u86cb\u767d\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u7684\u672a\u77e5\u86cb\u767d\u3002 \u5b9e\u9a8c\u539f\u7406\uff1a\u5229\u7528\u91cd\u7ec4\u6280\u672f\u5c06\u63a2\u9488\u86cb\u767d\u4e0eGST\uff08Glutathione S transferase\uff09\u878d\u5408\uff0c\u878d\u5408\u86cb\u767d\u901a\u8fc7GST\u4e0e\u56fa\u76f8\u5316\u5728\u8f7d\u4f53\u4e0a\u7684GTH\uff08Glutathione\uff09\u4eb2\u548c\u7ed3\u5408\u3002\u56e0\u6b64\uff0c\u5f53\u4e0e\u878d\u5408\u86cb\u767d\u6709\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u7684\u86cb\u767d\u901a\u8fc7\u5c42\u6790\u67f1\u65f6\u6216\u4e0e\u6b64\u56fa\u76f8\u590d\u5408\u7269\u6df7\u5408\u65f6\u5c31\u53ef\u88ab\u5438\u9644\u800c\u5206\u79bb. \u8bd5\u5242\uff1aNaCl\uff0c KCl\uff0cNa2HPO4\uff0cKH2PO4\uff0cTriton-100\uff0cIPTG(Merck\u5206\u88c5)\uff0cPMSF\uff08Amersco\uff09\uff0cCocktaier\uff08Merck 539134\uff09\uff0cImmobilized Glutathione\uff08PIERCE 15160\uff09 \u5b9e\u9a8c\u64cd\u4f5c\u7a0b\u5e8f\uff1a \u6750\u6599\u53ca\u8bd5\u5242 \u63a2\u9488\u86cb\u767d\u4e0eGST\u878d\u5408\u7684\u539f\u6838\u86cb\u767d\uff0c\u88c2\u89e3\u7684\u7ec6\u80de\u86cb\u767d\uff0c\u6216\u8005\u7ec4\u7ec7\u86cb\u767d\u63d0\u53d6\u7269
\u3000\u3000\u7ec6\u80de\u86cb\u767d\u88c2\u89e3\u6db2\uff0c\u6d17\u8131\u6db2\uff1a PBS\u53caPBS+1%Triton-100 PBS (1L) NaCl\uff1a 8g KCl\uff1a 0.2g Na2HPO4\uff1a 1.44g KH2PO4\uff1a 0.24g \u52a0\u5165800ml\u84b8\u998f\u6c34\uff0c\u7528HCl\u8c03\u8282\u6eb6\u6db2\u7684pH\u503c\u81f37.4\uff0c\u6700\u540e\u52a0\u84b8\u998f\u6c34\u5b9a\u5bb9\u81f31L\u5373\u53ef\uff0c\u9ad8\u6e29\u9ad8\u538b\u706d\u83cc\uff014\u2103\u4fdd\u5b58\u5907\u7528\uff01 PMSF(\u82ef\u7532\u57fa\u78fa\u9170\u6c1f) MW:174.19 \u5de5\u4f5c\u6d53\u5ea60.1-1mM\uff0c\u8fd9\u91cc\u4f7f\u75281mM\uff0c\u50a8\u5b58\u6d53\u5ea6100mM\uff0c\u5c060.174g PMSF\u6eb6\u4e8e10ml\u65e0\u6c34\u4e59\u9187\u6df7\u5300\u5373\u53ef\uff01\u4fdd\u6301\u4e8e-20\u2103\u6216\u80054\u2103 \uff08\u4ee5\u4e0b\u6d41\u7a0b\u4ec5\u4f9b\u7814\u7a76\u5df2\u77e5\u539f\u6838\u86cb\u767dA\u548c\u771f\u6838\u8fc7\u8868\u8fbe\u86cb\u767dB\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\uff09 1\uff1a\u539f\u6838\u878d\u5408\u86cb\u767dA\u7684\u83b7\u5f97 1.1\uff1a\u5c06\u7f16\u7801\u86cb\u767dA\u4e0eGST\u7684\u91cd\u7ec4\u8d28\u7c92\u5316\u8f6cBL21(DE3)\u83cc\u682a 1.2\uff1a\u6311\u53d6\u5355\u4e2a\u514b\u9686\u5230\u542b\u67095mlLB(+100ug/mlAmp)\u768410ml\u8bd5\u7ba1\u91cc\uff0c37\u2103\u57f9\u517b\u8fc7\u591c 1.3\uff1a\u5c06\u57f9\u517b\u83cc\u6db2\u8f6c\u79fb\u5230\u542b\u6709500ml LB(+100ug/mlAmp)\u76841L\u9525\u5f62\u74f6\u4e2d\uff0c37\u2103\uff0c225rpm\u57f9\u517b\u81f3OD600\u22481.0-1.5\u5de6\u53f3\uff0c\u52a0\u5165\u9002\u5f53\u6d53\u5ea6\u7684IPTG\uff0c\u5728\u9002\u5f53\u6e29\u5ea6\u4e0b\u57f9\u517b\u9002\u5f53\u65f6\u95f4\uff08\u8bf1\u5bfc\u6761\u4ef6\u9700\u8981\u6839\u636e\u4e0d\u540c\u7684\u86cb\u767d\u505a\u8c03\u6574\uff09.6000g\uff0c10\u5206\u949f\uff0c4\u2103\u79bb\u5fc3\u6536\u96c6\u7ec6\u83cc\uff0c\u53bb\u5c3d\u4e0a\u6e05\uff0c\u5c06\u83cc\u4f53\u81f3\u4e8e-20\u2103\u653e\u7f6eO/N 1.4\uff1a\u5ba4\u6e29\u51bb\u878d\u83cc\u4f53\uff0c\u9a6c\u4e0a\u7f6e\u4e8e\u51b0\u4e0a\uff0c\u6bcf500ml\u57f9\u517b\u6db2\u52a0\u516510-20ml\u7ec6\u83cc\u88c2\u89e3\u6db2\uff08PBS+1%Triton-100+PMSF\uff09\uff0c\u5439\u6253\u6df7\u5300 1.5\uff1a\u51b0\u4e0a\u8d85\u58f0\u7834\u788e\uff0c\u5f002\u79d2\uff0c\u505c9\u79d2\uff0c\u603b40-60\u5206\u949f\u3002\u81f3\u88c2\u89e3\u6db2\u5145\u5206\u6e05\u51c9 1.6\uff1a11000rpm\uff0c15\u5206\u949f\uff0c4\u2103\u79bb\u5fc3\u5206\u79bb\u4e0a\u6e05\uff0c -80\u2103\u4fdd\u5b58\u5907\u7528 2\uff1a\u771f\u6838\u878d\u5408\u86cb\u767dB\u7684\u83b7\u5f97
\u3000\u30002.1\uff1a\u5c06\u7f16\u7801B\u86cb\u767d\u7684\u78b1\u57fa\u5e8f\u5217\u514b\u9686\u5230\u7f16\u7801\u6807\u7b7e\u86cb\u767d\uff08\u5982HA,\u6216\u8005myc\uff09\u7684\u771f\u6838\u8868\u8fbe\u8f7d\u4f53\u4e0a\uff0c\u8fdb\u884c\u7ec6\u80de\u8f6c\u67d3 xq 3\uff1a48\u5c0f\u65f6\u540e\uff0c\u53d6\u9002\u91cf\u878d\u5408\u86cb\u767dGST-A\u51b0\u4e0a\u51bb\u878d 4\uff1a\u53d650-70ulGST-Beads\uff08Immobilized Glutathione\uff09\u5230EP\u7ba1\u4e2d\uff0c\u7528800ul PBS+1%Triton-100\u6da6\u6d17\u4e00\u6b21\uff0c\u5c06\u51bb\u878d\u878d\u5408\u86cb\u767dGST-A\u4e0e\u4e4b\u6df7\u5300\uff0c4\u2103\u5c42\u6790\u67dc\u65cb\u8f6c\u7ed3\u54081\u5c0f\u65f6\u3002 5\uff1aPBS+1%Triton-100\u6d173\u6b21\uff0cPBS\u6d173\u6b21\u3002\u7559\u53d620ul\uff08 PBS+Beads\uff09\u4f5cOffer\u3002 6\uff1a\u540c\u65f6\uff0c\u88c2\u89e3\u771f\u6838\u878d\u5408\u86cb\u767dB\uff0c\u53bb\u5c3d\u57f9\u517b\u57fa\uff0c\u7528PBS(RT)\u6d17\u4e00\u6b21\uff0c\u52a0\u5165300ul\u88c2\u89e3\u6db2\uff08\u4ee56well\u4e3a\u4f8b\uff0cPBS+1%Triton-100+ Cocktaier\uff09\uff0c4\u2103\u653e\u7f6e30\u5206\u949f\u3002 7\uff1a\u5439\u6253\u6536\u96c6\u81f31.5mlEP\u7ba1\uff0c\u8d85\u58f0\u7834\u788e\u300213000rpm\uff0c15\u5206\u949f\uff0c4\u2103\u79bb\u5fc3\u53d6\u4e0a\u6e05\u3002 8\uff1aBCA\u86cb\u767d\u5b9a\u91cf\uff08optional\uff09\u7559\u53d620ul\u505aOffer\uff0c\u5176\u4f59\u6837\u54c1\u52a0\u5165\u5230\u5df2\u7eaf\u5316\u86cb\u767d\u7684EP\u7ba1\u4e2d\uff0c\u7528PBS\u8865\u8db3\u6db2\u4f53\u5230600ul\u5de6\u53f3\uff0c\u4ee5\u4fbf\u86cb\u767d\u4e4b\u95f4\u80fd\u5145\u5206\u7ed3\u5408\uff014\u2103\u65cb\u8f6c\u7ed3\u5408O/N9\uff1aPBS+1%Triton-100\u6d173\u6b21\uff0cPBS\u6d173\u6b21\u3002 10\uff1a40ul 5\u00d7loading buffer\u6eb6\u89e3beads\u4e0a\u7684\u86cb\u767d\uff0c\u716e\u6cb83\u5206\u949f\uff0c\u9ad8\u901f\u79bb\u5fc3\uff0cRun \u2013SDS PAGE\u505aWestern Blot\u68c0\u6d4b\u3002\u7528HA\u6216\u8005myc Blot\u3002 \u6ce8\u610fGST-pull down\u7684\u5bf9\u7167\u95ee\u9898\u3002\uff08\u4ee5A-GST\u548cB-6*His\u4e3a\u4f8b\uff09 1. \u8dd1SDS-PAGE\u65f6\u70b9\u4e00\u4e2a input\u7684\u86cb\u767d\uff08\u5373B-6*His\uff09 \u7528\u4e8e\u505a\u9633\u6027\u5bf9\u7167 \u770b\u4e00\u4e0bwestern\u64cd\u4f5c\u8fc7\u7a0b\u4e2d\uff0c\u8bd5\u5242\uff0c\u64cd\u4f5c\u6b65\u9aa4\u6709\u6ca1\u6709\u95ee\u9898\u3002 2. \u8c37\u80f1\u7518\u80bd\u743c\u8102\u73e0\u4e0a\u53ea\u56fa\u5b9aGST\u86cb\u767d\uff0cinput B-6*His\uff0c\u7528\u4e8e\u505a\u9634\u6027\u5bf9\u7167 \u770b\u4e00\u4e0b\u662f\u5426GST\u4f1a\u4e0einput\u7684\u86cb\u767d\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528 Protocol for Immunoprecipitation or GST-pull down 1. Wash the cell monolayer once with cold PBS. 2. Treat the cells with 2mM 3,3\u2019-dithiolbissulfosuccinimidylpropionate/PBS at 4ºC for 25 min to crosslink the associated proteins. (optional) 3. Scratch off the cells, and spin down at 4ºC at 1000rpm for 5 min. 4. Decant the supernatant. 5. Resuspend the cell pellet in appropriate amount of IP-Buffer A, sonicate at 40%
\u3000\u3000output for 10 sec, and incubate the lysate at 4ºC for 45min. 6. Spin at highest speed at 4ºC for 5 min. 7. Recover the supernatant and detect protein concentration with Bradford Reagent (Bio-Rad). 8. Take 500ug proteins, mixed with 4 volume of IP-Buffer B. 9. Preclear the lysate by adding 1ug normal IgG and 5ul protein-G beads (Sigma), incubate on a rotator at 4ºC for 1hr. For GST-pull down assay, add 1ug GST protein and 5ul glutathione-sepharose 4B beads instead. 10. Spin down the beads at 4ºC at 10000rpm for 3min. 11. Recover the supernatant, add 1ug specific antibody or normal IgG, and incubate on a rotator at 4ºC for 2hr. For GST-pull down assay, add 1ug GST-fused specific protein or equal molar of GST protein instead. 12. Add 5ul of 5ul protein-G or glutathione-sepharose 4B beads, and incubate for another 2hr or overnight. 13. Spin down the beads at 4ºC at 2000rpm for 3min. Caution: There will be some white pellets just above the beads on the tube wall, which are protein precipitates due to denature. Remove away these precipitates, otherwise they will give false binding band in both control and test groups, affecting the explanation of the results. Check this phenomena at every washing step. 14. Wash the beads with 1ml of IP Washing buffer on a rotator at 4ºC for 5min. 15. Spin down the beads at 4ºC at 2000rpm for 3min. 16. Repeat step 14 and 15 for three more times. 17. Resuspend the pellet in 25ul 1xSDS loading buffer and incubate at RT for 30min. 18. Spin at 3000rpm at RT for 5min. 19. Recover the supernatant and put at \u201320ºC or subjected to SDS-PAGE running. 20. For the input control, 25ug protein will be included in gel running. Caution: to avoid the interference of IgG heavy chain with specific proteins with MW around 50KD, 1x SDS loading buffer without beta-mercaptoethanol or DTT can be used instead. At this condition, the interchain cysteine-cysteine bond will be maintained, giving IgG band at 100KD or so. IP-Buffer A: 50mM Tris-Cl PH 7.5 150mM NaCl 1mM EDTA PH8.0 0.5% Triton X-100 plus Protease Inhibitors (Roche) IP-Buffer B: IP-Buffer A minus Triton X-100. IP Washing Buffer: 50mM Tris-Cl PH 7.5 150mM NaCl
\u56e0\u4e3a\u6b64\u65b9\u6cd5\u7b80\u5355\u6613\u884c,\u64cd\u4f5c\u65b9\u4fbf\u3002
GST pull-down\u5b9e\u9a8c\u662f\u4e00\u4e2a\u884c\u4e4b\u6709\u6548\u7684\u9a8c\u8bc1\u9175\u6bcd\u53cc\u6742\u4ea4\u7cfb\u7edf\u7684\u4f53\u5916\u8bd5\u9a8c\u6280\u672f,\u8fd1\u5e74\u6765\u8d8a\u6765\u8d8a\u53d7\u5230\u5e7f\u5927\u5b66\u8005\u7684\u9752\u7750\u3002
\u5176\u57fa\u672c\u539f\u7406\u662f\u5c06\u9776\u86cb\u767d-GST\uff08Glutathione-S-transferase\u8c37\u80f1\u82f7\u80bd\u5def\u57fa\u8f6c\u79fb\u9176\uff09\u878d\u5408\u86cb\u767d\u4eb2\u548c\u56fa\u5316\u5728\u8c37\u80f1\u7518\u80bd\u4eb2\u548c\u6811\u8102\u4e0a,\u4f5c\u4e3a\u4e0e\u76ee\u7684\u86cb\u767d\u4eb2\u548c\u7684\u652f\u6491\u7269,\u5145\u5f53\u4e00\u79cd\u201c\u8bf1\u9975\u86cb\u767d\u201d,\u76ee\u7684\u86cb\u767d\u6eb6\u6db2\u8fc7\u67f1,\u53ef\u4ece\u4e2d\u6355\u83b7\u4e0e\u4e4b\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u7684\u201c\u6355\u83b7\u86cb\u767d\u201d(\u76ee\u7684\u86cb\u767d),\u6d17\u8131\u7ed3\u5408\u7269\u540e\u901a\u8fc7SDS-PAGE\u7535\u6cf3\u5206\u6790,\u4ece\u800c\u8bc1\u5b9e\u4e24\u79cd\u86cb\u767d\u95f4\u7684\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u6216\u7b5b\u9009\u76f8\u5e94\u7684\u76ee\u7684\u86cb\u767d,\u201c\u8bf1\u9975\u86cb\u767d\u201d\u548c\u201c\u6355\u83b7\u86cb\u767d\u201d\u5747\u53ef\u901a\u8fc7\u7ec6\u80de\u88c2\u89e3\u7269\u3001\u7eaf\u5316\u7684\u86cb\u767d\u3001\u8868\u8fbe\u7cfb\u7edf\u4ee5\u53ca\u4f53\u5916\u8f6c\u5f55\u7ffb\u8bd1\u7cfb\u7edf\u7b49\u65b9\u6cd5\u83b7\u5f97\u3002
此方法的基本原理是：利用重组技术将探针蛋
白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋
白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）
亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白
通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸
附而分离。在病毒受体研究中，融合蛋白通常设计
为病毒吸附蛋白（VAP）。这方面成功的例子有
HBV[28]。具体做法如下：将GST-融合探针蛋白
（VAP）和GTH-Sepharose制成亲和层析柱，然后待
分析的蛋白质混合液流经亲和层析柱，梯度洗脱，
分离、收集各蛋白组分，这称为GST亲和柱层析
（GST affinity column chromatography）。如果一开
始待检蛋白就和GST- 融合探针蛋白与
GTH-Sepharose一起共同孵育，经离心收集洗脱复
合物和洗涤后，再加入过量GTH获得相互作用蛋白
的复合物，那么这种方法则称为GST pull down。
GST亲和层析及相应的GST Pull-down方法的
优点是敏感，对混合物中的所有蛋白均“一视同仁”，
也可用于受体功能的鉴定。缺点是GST有可能影响
融合蛋白的空间结构，另外，蛋白质浓度对实验也
有一定影响。
3.6 酵母双杂交技术
许多真核生物的转录激活因子通常具有两个
可独立存在的结构域，即DNA结合域（BD）与转
录激活域（AD）。这两个结构域各具功能，互不影
响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必
须同时含有这两个结构域。不同来源的激活因子的
BD区与AD结合后则可特异地激活被BD结合的基
因表达。基于这个原理，人们将两个待测蛋白分别
与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个
酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用
就会使AD与BD形成完整的转录激活因子并激活相
应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用.
酵母双杂交系统由三个部分组成：①与BD融合
的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；
②AD融合的蛋白表达载体，其表达的蛋白称靶蛋
白（prey）；③带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3、URA3、LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的营养缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营
养标记基因，有利于杂交质粒的鉴定与分离。根据
目前通用系统中BD来源主要分为GAL4系统和
LexA系统。后者因BD来源于原核生物，在真核生
物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
近年来，开始出现了应用酵母双杂交技术进行
病毒受体研究的成功报告，如麻疹病毒的绒猴细胞
受体[30]。李凌云等构建了表达“猎物”（prey）蛋白
的质粒和表达病毒VAP“诱饵”（bait）蛋白的质粒，
然后共转染同一酵母细胞，利用已建立的易感细胞
cDNA文库，筛到了阳性克隆。
酵母双杂交技术的优点是灵敏度高，特异性较
好，缺点是容易出现假阳性和假阴性，而且对蛋白
质在细胞中的定位有要求。
为了克服上述缺点，人们进一步优化出所谓“双
筛选系统”，即蛋白质相互作用必须同时激活两个
以上报道基因，具有两种以上的相应表型才算是真
的阳性结果。另外，人们也改造了酵母双杂交系统
所用的载体系统，将在细胞浆内发生的蛋白质相互
作用转移到细胞膜上进行，以此来更容易地筛选膜
蛋白受体，如Ras recruitment system（RRS）。
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