石蜡切片检测肝糖原的方法及原理
肝糖原是人和动物体内的储备多糖，有动物淀粉之称。肝糖原在酶促作用下合成和分解以维持血糖浓度的稳定。检测肝糖原含量的变化在医学病理学上可用于糖原累积病、糖尿病和某些肿瘤的诊断。高碘酸希夫氏（Periodic acid-Schiffs, PAS）染色法是检测糖原的经典组织化学方法，该法先用高碘酸将糖类相邻的两个碳上的羟基氧化成醛基，再用Schiff’s试剂（无色品红）和醛基反应产生红色或紫色物质，红色的深浅反映组织细胞中糖原的含量（Ref：两种切片方法检测肝糖原染色效果的比较）。该法常用来显示糖原和其他多糖，该染色液不仅能够显示糖原，还能显示中性黏液性物质和某些酸性物质，以及软骨、垂体、霉菌、真菌、色素、淀粉样物质、基底膜等（Ref：https://www.solarbio.com/goods-4761.html）。
过碘酸（又称高碘酸）是一种强氧化剂，它能氧化糖类及有关物质中的1，2-乙二醇基，使之变为二醛，醛与Schiff试剂能结合成一种品红化合物，产生紫红色。由于高碘酸还可氧化细胞内其他物质，使用时应注意选择好高碘酸浓度和氧化时间，使氧化控制在即能把乙二醇基氧化成醛基，又不至于过氧化，这是很关键的步骤（Ref：https://www.solarbio.com/goods-4761.html）。
PAS技术是唯一可检测不同种类的黏液物质（如糖原、黏蛋白和糖蛋白）的方法，但PAS技术却不能区别黏蛋白和糖原。若要准确鉴别黏液物质（如黏蛋白和糖原），需加入糖原消化步骤。大多数情况下可用α-淀粉酶或麦芽淀粉酶来催化糖原的糖苷键水解。形成水溶性的双糖-麦芽糖，在应用PAS技术之前将糖原从组织切片上除去。人类的唾液被认为是消化糖原的一种有效手段，但是出于安全以及缺乏标准唾液的考虑，不主张应用唾液（Ref：https://www.solarbio.com/goods-4761.html）。
糖原D-PAS染色液的特点在于糖原PAS染色之前经淀粉酶处理，糖原消化时需要两张相同的切片，脱蜡后一张切片用含有淀粉酶的适当缓冲液处理，另一张仅用缓冲液处理。然后两张切片均用PAS法染色，消化后染色消失表明存在糖原（Ref：https://www.solarbio.com/goods-4761.html）。
实验步骤：
对照组：
石蜡切片，脱蜡至50%乙醇中，稍用水洗，滴加唾液淀粉酶溶液于37℃温箱中消化处理30min。
实验组：
在对照组消化过程中，准备石蜡切片，脱蜡至50%乙醇中，稍用水洗，加入0.5%高碘酸氧化7min，流水冲洗5min，再用蒸馏水浸洗两次；
冰箱取出无色品红，恢复至室温后避光染色15-20min；
用0.5%的偏重亚硫酸钠漂洗两次，每次1min，流水冲洗5min，蒸馏水洗后用哈瑞苏木精或迈耶苏木素染色2min（视具体情况而定）。自来水洗，0.1%盐酸乙醇分化1min，水洗充分后温水返蓝，流水冲洗，42℃温箱烘干24h，中性树胶固封后拍照；
光密度分析（Image-Pro Plus图像分析软件），检测切片中PAS阳性部位的累计光密度和面积，计算平均光密度（mean optical density）；
数据分析：ANOVA；
染色结果预测：PAS染色后糖原颗粒呈红色或紫红色，石蜡切片染色后显示肝脏组织结构清晰，但肝细胞中有较多空泡，糖原流失较多。
注意事项 ：1.固定液的选择，对于糖原的原位保存非常重要，可以4℃固定，减少流失；2.3um石蜡切片做这个实验比较好；3.品红配好后需要4℃避光保存；4.失效的品红0.5g/100ml的偏重亚硫酸钠可恢复染色能力；5.唾液淀粉酶消化时间需要严格把握，太短糖原分解不彻底，太长影响组织结构；6.糖原溶于水，在切片未经高碘酸氧化前不宜与水接触，否则糖原会大量流失。
试剂准备和配置：
Carnoy固定液： 纯酒精60 ml 冰醋酸10ml氯仿 30ml, 也可以选用75%酒精。
过碘酸酒清夜配法: 过碘酸(HIO4·2H2O) 0.4g 95%酒精 35ml M/5醋酸钠(2.72g+蒸馏水100ml)，5ml蒸馏水10ml。保存于冰箱内，用棕色瓶，可用两周。
Schiff氏液: 0.5克碱性品红加入100毫升蒸馏水中，时时摇动三角瓶5分钟，使之充分溶解。冷却至50℃后过滤加入10毫升1N盐酸，冷却至25℃，加入0.5-1克偏重亚硫酸钠，在室温中至少静置24小时,然后密封冰箱保存。
Schiff氏酒精液配置：Schiff氏液 11.5ml， 1N HCI 0.5ml，纯酒精23ml。
亚硫酸水： 1%偏重亚硫酸钠10ml，1N HCI 10ml，蒸馏水180ml的树胶溶解。
哈瑞或迈耶苏木精。
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