微生物问题,请教一下 你好，老师！我有问题请教一下，做微生物大肠菌群实验的时候，单...
\u6211\u60f3\u8bf7\u6559\u4e00\u4e0b\u5404\u4f4d\uff0c\u5728\u5fae\u751f\u7269\u7684\u7eaf\u7cfb\u5206\u79bb\u8fc7\u7a0b\u4e2d\u5e94\u6ce8\u610f\u54ea\u4e9b\u95ee\u9898\uff1f\u6ce8\u610f\u4e0d\u8981\u8ba9\u5176\u5b83\u7ec6\u83cc\u4fb5\u5bb3\uff0c\u9632\u6b62\u751f\u957f\u8fc7\u7a0b\u4e2d\u53d8\u5f02\uff01\uff01\u518d\u5c31\u662f\u6e29\u5ea6\u548c\u6e7f\u5ea6\u8981\u9002\u5b9c
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对青霉素有抗性就是抗Amp1.设定不同浓度梯度的Amp，与你需要的培养基混合均匀，倒平板（Amp是不能高温高压灭菌的，也不能用紫外灭菌，只能用过滤除菌的哦，记住，如果不是就失效了）
2.将你要分离目的细菌的混合液取少量，在上述平板上用涂布器涂布均匀，合适温度培养。
3.选取能长出少量单菌落的平板，记得那个平板的Amp浓度
4.用接种环挑取单菌落，在该Amp浓度的平板上画线分离，还要进行镜检，确定是一种还是多种这样的细菌。则可以分离到你想要的细菌了。
注意：每个浓度的Amp平板要做多个平衡。
第一部分 实验的目
《环境微生物学及实验》实验课是我院环境科学专业学生必修的一门重要的基础实验课，是学生进入我院实验室的第一门实验课。
《环境微生物学及实验》实验的目的是使学生掌握微生物学的基本实验方法和技术，正确的使用实验的仪器设备，在学生头脑中建立无菌概念和掌握无菌操作技能是最重要的内容，是学生进行后续课实验和研究的基础。在目前的实验室条件和有限学时的情况下，得到微生物实验技术的基本操作和技能训炼，培养学生动手操作能力和创新能力。通过微生物学实验课教学，加深理解和巩固课堂所学的知识，熟悉微生物学实验的基本操作技术，了解微生物实验的基础知识。通过微生物学实验培养学生观察、思考、分析问题、解决问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度、创新精神、创新思维和创新能力。
我们在二十年微生物学实验教学经历的基础上，参考国内兄弟院校和国外有关教材，总结、综和各方面的经验，编写了本实验指导书，力求在各个实验里安排尽量多的微生物实验基本操作和微生物学知识点。
本实验指导书书主要内容包括：微生物个体和菌落形态观察、染色方法、培养基制备和灭菌、无菌操作、微生物检测和分离、生理生化反应、影响微生物生长的因素和污染物微生物降解实验，水中微生物分布调查等内容。同时也注意和环境微生物学的联系与区别。
整个实验课中贯穿了显微镜使用——三种灭菌方法——无菌操作——环境工程微生物菌种分离筛选鉴定、选育——污染物分解和调查这一主线。微生物学需掌握的基本操作在实验中得到训练，同时加深了学生对所学微生物学基本概念的理解。实验设计贴近生活，可以大大提高同学们学习微生物学的兴趣。实验内容与目录如下：
实验一 光学显微镜的使用及示教片的观察
实验二 微生物的染色技术及细菌的观察
实验三 原生动物、微型后生动物、藻类和活性污泥的观察
实验四 培养基的制备和灭菌
实验五 细菌淀粉酶和过氧化氢酶定性实验及其生化特征观察
实验六 纯种微生物的分离、转种和培养
实验七 有机污染物质的生物降解实验*
实验八 污染土壤和水体中细菌总数的测定*
*注：实验六、实验七、实验八选做其一。
第二部分 微生物学实验室规则
微生物学实验的对象大多为环境微生物，其中某些微生物对人体具有危害性，因此要求进入实验室后必须严格遵守以下实验室规则：
1.进入实验室应先穿白大衣，离开实验室时要脱下白大衣，反折放回原处，不必要的物品不得带入实验室，必须带入的书籍和文具等应放在指定的非操作区，以免受到污染。无菌操作时必须戴口罩，并不得开电风扇。
2．进入实验室进行实验前应先洗手，避免手上的分秘物，食物油，护肤用品和沾染的微生物等对实验造成污染。
3．实验室内禁止饮食、抽烟，不得高声说笑或乱走乱串。
4．各种实验物品应按指定地点存放，用过的器材必须经消毒处理，禁止随意放于桌上或冲入水槽。
5．须送恒温生化培养箱培养的物品，应做好标记（标明姓名、编号、日期、培养时间）后送到指定地点。
6．实验过程中如发生意外事故时，禁止隐瞒或自作主张不按规定处理，应立即报告老师进行正确的处理。如有传染性、腐蚀性的材料污染桌面、地面等，应立即用0. 2%-0. 5% “84”消毒液浸泡污染部位，作用5～10min后方可抹去。如手被活菌污染也应使用上述消毒液浸泡5～10min或肥皂清洗后，再以自来水反复冲洗干净，必要时去卫生所或医院就医。
7．爱护室内仪器设备，严格按操作规则使用。节约使用实验材料，不慎损坏了器材等，应主动报告老师进行处理。
8．实验完毕，应物归原处、将台面整理清洁，将实验室打扫干净。最后以肥皂洗手后方可离开实验室。
第三部分 实验内容
实验一、光学显微镜的使用及示教片的观察
实验项目性质：基础验证性实验
所属课程名称：《环境微生物学及实验》
实验计划学时：4学时
一、实验目的
1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。
2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理
现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常 被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：
1. 增加照明亮度
油镜的放大倍数可达 100 Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（ n=1.55 ）相仿的油镜（通常用香柏油，其折射率 n=1.52）。
2. 增加显微镜的分辨率
显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，分辨力D可表示为：D=λ/2N.A，式中λ= 光波波长； NA= 物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7 μ m ），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：
NA=n × sin α
式中α为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到 120 O ，而 n 为介质折射率。由于香柏油的折射率（ 1.52 ）比空气及水的折射率（分别为 1.0 和 1.33 ）要高，因此以香柏油作为镜头于玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA 一般在1.2-1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（ NA 都低于 1.0）。若以可见光的平均波长 0.55 μm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到 0.2 μ m 左右。
三、实验器材
1. 菌种：枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）染色玻片标本。青霉（Penicillium sp.）的水封片等（教师可根据具体情况选用菌种）。
2. 溶液或试剂：香柏油、乙醇：乙醚混合液
3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。
四、操作步骤
1. 观察前的准备
（1） 显微镜的安置：置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约3-4cm 。镜检时姿势要端正。
取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。
（2） 光源调节：安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。
（3）根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。
（4） 聚光器数值孔径值的调节：调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应进行这种调节。
在聚光器的数值孔径值确定后，若需改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈的调节。当然，有关虹彩光圈、聚光器高度及照明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察效果，有时也可根据不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。
2. 显微观察
在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。
（1） 低倍镜观察 金黄色葡萄球菌染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降 10 Χ物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节图象清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。
在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜*近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。
（2） 高倍镜观察 低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。
在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦 (parfocal) 。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。
（3） 油镜观察 高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过 1.0 ，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。
有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。
3. 显微镜用毕后的处理
（1） 上升镜筒，取下载玻片。
（2） 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
（3） 用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。
（4） 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。
五、实验报告
1.分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌及青霉的形态，包括在三种情况下视野中的变化。同时注明物镜放大倍数和总放大率。
六、思考题
1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？
2、试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？
3、什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？
4、影响显微镜分辨率的因素有哪些？
5、根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的观察。
实验二、微生物的染色技术及显微镜观察
实验项目性质：基础验证性实验
所属课程名称：《环境微生物学及实验》
实验计划学时：4学时
一、细菌的简单染色法
1 目的
1.1 学习微生物涂片、染色的基本技术。
1.2 掌握细菌的简单染色法。
1.3 初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。
2 原理
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。
3 材料
3.1 菌种
枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物、面包酵母琼脂斜面培养物。实验教师可根据具体情况提供合适的菌种。
3．2 染色剂
吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液。
3.3 仪器或其他用具
显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。
4 流程
涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。
5 步骤
5.1 涂片
取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸溜水)于玻片中央，用接种环以无菌操作，分别从枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。
5.2 干燥
室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。
5.3 固定
如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。 涂片、干燥和热固定。
5.4 染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min 。
5.5 水洗
倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。
5.6 干燥
甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。
5.7 镜检
涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。
6 结果
绘制单染色后观察到的大肠杆菌和藤黄微球菌的形态图。
二、革兰氏染色法
1 目的
1.1 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
1.2 学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。
2 原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
3 材料
3.1 菌种
大肠杆菌（Escherichia coli）约24h营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）约16h牛肉膏琼脂斜面菌种一支。
3.2 染色剂
结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。
3.3 仪器或其他用具
显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。
4 流程
涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。
5 步骤
5.1 涂片
5.1.1 常规涂片法
取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
5.2 初染
滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
5.3 媒染
用卢戈氏碘液媒染约l min ，水洗。
5.4 脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。
5.5 复染
在涂片上滴加番红液复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。
5.6 镜检
干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。
5.7 实验结束后处理
清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。
三、实验结果
1 根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
2列表简述两株细菌的染色结果(菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。
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