EMSA实验蛋白为什么进不到PAGE胶内 EMSA的原理是什么

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将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合,蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%,在特定条件下可用高或低的浓度。也可将TGE缓冲液(12.5mM Tris,pH8.3,95mM 甘氨酸,0.5mM EDTA)用于不稳定的蛋白/DNA复合物。在4℃进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。
当带型不紧密出现拖尾时,表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合,以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量,或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物,但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染,应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三种波长四款紫外交联仪,主要包括VL-1000A系列紫外交联仪(365nm)、VL-1000B系列紫外交联仪(302nm)、VL-1000C系列紫外交联仪(254nm)、VL-3000系列紫外交联仪(三种波长)满足不同的科研需求。

单抗与多抗都可用于Super-Shift EMSA,但多抗可能与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下,虽然看不到Super-Shift的带,但应当可以看到.

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