技术 | 引物和探针的制备方法一览

在生命科学的精密舞台上，引物和探针的制备如同调色盘上的魔法，它们以多种方式确保实验的准确性和可视化。这些关键工具通过化学合成、PCR扩增和重组DNA技术精心打造，每一步都关乎结果的精确性和可靠性。

化学合成的奥秘

化学合成是制备引物和探针的常用手段。从单链的寡核苷酸（19-25个碱基）起，通过磷酰胺合成，每个碱基如同乐高积木般精确构建。关键在于标记，例如FITC、DIG或生物素，它们以11-16个核苷酸间隔巧妙地连接，确保与目标序列的稳定结合，同时不影响后续检测（图1）。

碱基艺术与创新设计

碱基类似物，如LNA，以甲基键嵌入核糖，提供更高的特异性，而图2中的LNA结构揭示了这种创新设计的魅力。它在特定位置增强Tm值，提高杂交稳定性。

在PCR扩增中，探针可以通过标记引物或dNTPs进行创建。在PCR产物纯化后，探针的标记可以进一步通过切割和平移，或随机引物添加实现，如图5所示，每一步都精心设计以确保高效和精确的检测。

重组DNA技术的探索

对于长靶点，重组DNA技术则发挥关键作用，通过克隆技术将大片段DNA插入载体，如质粒或噬菌体，确保探针与大目标的完美匹配。这种方法在特定条件下，如需要高分辨率检测时尤为实用（图3）。

引物和探针的长度与性能息息相关。理想情况下，15-20个核苷酸的寡核苷酸能在保持高效杂交的同时，兼顾一致性。过长的探针可能降低纯度，因此在原位杂交中，通常选择多个短片段而非一个大片段（图4）。

探索与应用的广阔领域

寡核苷酸探针因其长寿命、高纯度和成本效益，广泛应用于实时PCR和常规杂交实验。专业公司提供各种定制选项，无论是有标记或无标记，纯度不同，都确保了科学家们的便利与实验的成功（图5）。