植物DNA提取
原理是一致的。方法不同。1
植物组织
提取基因组DNA
一、材料
幼嫩叶子。
二、设备
移液器
，
冷冻高速离心机
，
台式高速离心机
，
水浴锅
，陶瓷
研钵
，50ml
离心管
（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小
玻棒
。
三、试剂
1、提取
缓冲液
Ⅰ：100mmol/L
Tris·Cl,
pH8.0,
20mmol/L
EDTA,
500mmol/L
NaCl,
1.5%
SDS。
2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g
二乙基二硫
代
碳酸钠
，6.0gPVP，240ul
巯基乙醇
，加水至300ml。
3、80:4:16/氯仿:
戊醇
:乙醇
4、
RnaseA
母液
5、其它试剂：
液氮
、
异丙醇
、
TE缓冲液
，
无水乙醇
、70%乙醇、3mol/L
NaAc。
四、操作步骤：
1.
在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ,
60℃水浴预热。
2.
幼苗或叶子5-10g,
剪碎,
在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,
剧烈摇动混匀,
60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高),
不时摇动。
3.
加入20ml氯仿/戊醇/
乙醇溶液
,
颠倒混匀(需带手套,
防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟,
使水相和
有机相
分层(必要时可重新混匀)。
4.
室温下5000rpm离心5分钟。
5.
仔细移取
上清液
至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
6.
在1.5ml
eppendorf
中加入1ml
TE。用钩状
玻璃棒
捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
7.
如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,
再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
8.
将DNA溶液
3000rpm
离心5分钟,
上清液倒入干净的5ml离心管。
9.
加入5μl
RNaseA(10μg/μl),
37℃
10分钟,
除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
10.
加入1/10体积的3mol/L
NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
11.
用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
12.
将DNA重溶解于1ml
TE,
-20贮存。
13.
取2μl
DNA样品在0.7%
Agarose胶上电泳,
检测DNA的
分子大小
。同时取15μl稀释20倍,
测定OD260/OD280,
检测DNA含量及质量。
[注意]
5g样品可保证获得500μg
DNA,
足供RFLP、PCR等分析之用。
绛旓細浠ョ帀绫冲彾鐗囩殑DNA鎻愬彇涓轰緥 1 鍙3-5g鏂伴矞鐨勫辜瀚╃殑鐜夌背鍙剁墖锛屾垨鑰呭彇瀹屾潗鏂欏悗灏嗗叾鍐诲瓨浜庢恫姘腑鎴栦繚瀛樺湪锛70鈩冨鐢紱2灏嗗喎鍐荤殑鍙剁墖缃簬鐮旈挼涓紝鍔犲叆灏戣鐭宠嫳鐮傦紝娴囨恫姘爺鎴愮粏绮夊悗锛岃浆鍏50 mL鐨勭蹇冪涓紝鍔犲叆15ml 65ºC棰勭儹鐨2脳CTAB鎶芥彁缂撳啿娑诧紝鍐嶅姞鍏150µl尾-宸熀涔欓唶锛堢粓娴撳害涓1%锛夛紱3...
绛旓細锛5锛夐噸澶嶆楠わ紙4锛1-2娆,浠ヨ泲鐧藉眰涓嶅嚭鐜颁负姝紱锛6锛夊彇涓婃竻,-20鈩冩矇娣1h,4鈩,12000 r/min,绂诲績10 min锛涳紙7锛夊純鍘讳笂娓呮恫,鐢70%涔欓唶娲楁钉娌夋穩2娆★紱锛8锛夊娓╀笅骞茬嚗鍚庯紙涓鑸共鐕5-15 min锛,婧朵簬30-50 渭l DEPC鍘荤瀛愭按涓,浜-20鈩冩垨鑰-70鈩冧笅淇濆瓨澶囩敤.,7,CTAB鎻愬彇妞嶇墿涓DNA姝ラ鏄粈涔?1銆...
绛旓細纰辩叜娉鎻愬彇妞嶇墿DNA鐨勫師鐞嗘槸锛氶珮PH鐨勬憾娑蹭細浣跨粏鑳炲绮曠被浠庤屼娇寰桪NA鍜岃泲鐧借川鍙樻с
绛旓細DNA鎻愬彇娴撳害浣庡彲鑳芥湁浠ヤ笅鍘熷洜 1)瀹為獙鏉愭枡閲忓お灏戯紝寤鸿閫傚綋澧炲姞澧炲姞鏍锋湰閲忥紱2)鏍峰搧瑁傝В涓嶅厖鍒嗐備繚鎸佹牱鏈噺涓嶅彉鐨勬儏鍐甸傚綋澧炲姞瑁傝В娑层備娇鐢ㄦ恫姘垨鍖娴嗗櫒瀵规牱鍝佽繘琛岀爺纾ㄥ拰鍖娴嗭紝浣垮叾鍏呭垎娣峰寑锛岄傚綋寤堕暱瑁傝В鏃堕棿锛3)鎻愬彇鏉愭枡璐ㄩ噺涓嶅ソ銆備繚璇佹牱鍝佹湰韬獶NA鍚噺锛屽敖閲忛夌敤瀵屽惈鏍搁吀鐨勭粍缁囨垨鏂伴矞缁勭粐鎻愬彇鍩哄洜缁凞NA锛屾牱鍝...
绛旓細鎻愰珮骞茬嚗鐨勬鐗╄嵂鏉恉na鍚噺鎻愬彇鐨勮鐐癸細鎶芥彁缂撳啿娑插姞鍏ヤ竴瀹氶噺鐨勎插矾鍩轰箼閱囷紝鍙捣鍒伴槻姝㈤厷绫绘哀鍖栫殑浣滅敤锛屾彁楂榙na鎻愬彇鐨勪骇閲忋妞嶇墿DNA鎻愬彇锛欴NA鏄仐浼犱俊鎭殑杞戒綋锛屾槸鏈閲嶈鐨勭敓鐗╀俊鎭垎瀛愶紝鏄垎瀛愮敓鐗╁鐮旂┒鐨勪富瑕佸璞°備负浜嗚繘琛屾祴搴忋佹潅浜ゅ拰鍩哄洜鐨勮〃杈撅紝鑾峰緱楂樺垎瀛愰噺鍜岄珮绾害鐨凞NA鏄潪甯搁噸瑕佺殑鍓嶆彁銆
绛旓細1. 鐩稿悓鐐癸細涓ょ鎻愬彇鏂规硶閮芥槸浠庢鐗╃粍缁囦腑鍒嗙鍑篋NA銆2. 涓嶅悓鐐癸細鎻愬彇鐨勫璞′笉鍚岋紝妞嶇墿鎬籇NA鎻愬彇鐨勬槸妞嶇墿缁嗚優鍐呯殑鍏ㄩ儴DNA锛屽寘鎷嚎绮掍綋DNA鍜屽彾缁夸綋DNA锛岃岃川绮扗NA鎻愬彇鐨勬槸瀛樺湪浜庣粏鑳炶川涓殑鐜姸DNA鍒嗗瓙銆備互涓婃槸妞嶇墿鎬籇NA涓庤川绮扗NA鎻愬彇鐨勫紓鍚岀偣锛屽笇鏈涘鎮ㄦ湁鎵甯姪銆
绛旓細DNA鎻愬彇鐨勫嚑绉嶆柟娉 (1).娴撶洂娉 鍒╃敤RNP鍜孌NP鍦ㄧ數瑙ｆ憾娑蹭腑婧惰В搴︿笉鍚,灏嗕簩鑰呭垎绂,甯哥敤鐨勬柟娉曟槸鐢1M 姘 绾虫彁鍙栧寲閽犳娊鎻,寰楀埌鐨凞NP绮樻恫涓庡惈鏈夊皯閲忚緵閱囩殑 姘豢涓璧锋憞鑽,浣夸钩鍖,鍐嶇蹇冮櫎鍘昏泲鐧借川,姝ゆ椂铔嬬櫧璐ㄥ嚌鑳跺仠鐣欏湪姘寸浉鍙婃隘浠跨浉涓棿,鑰孌NA浣嶄簬涓婂眰姘寸浉涓,鐢2鍊嶄綋绉95%涔欓唶鍙皢DNA 閽犵洂娌夋穩鍑烘潵.涔...
绛旓細妞嶇墿DNA鎻愬彇鏂规硶鏄噰鐢–TAB娉曘侰TAB锛屾槸涓绉嶉槼绂诲瓙鍘绘薄鍓,鑳戒笌鏍搁吀褰㈡垚澶嶅悎鐗,姝ゅ鍚堢墿鍦ㄩ珮鐩(>0.7mol/L) 娴撳害涓嬪彲婧,骞剁ǔ瀹氬瓨鍦,浣嗗湪浣庣洂娴撳害(0.1锝0.5mol/L NaCl)涓婥TAB-鏍搁吀澶嶅悎鐗╁氨鍥犳憾瑙ｅ害闄嶄綆鑰屾矇娣,鑰屽ぇ閮ㄥ垎鐨勮泲鐧借川鍙婂绯栫瓑浠嶆憾瑙ｄ簬婧舵恫涓傞氳繃鏈夋満婧跺墏鎶芥彁,鍘婚櫎铔嬬櫧銆佸绯栥侀厷绫荤瓑...
绛旓細鍙栨牱鐨勬潗鏂欐渶瑕佹槸鏂伴矞鐨勶紝鑰屼笖鍙栧鍙讹紝濡傛灉鍙栬佸彾鐨勮瘽锛屽惈鏈夎緝澶氱殑澶氱硸鍜岄厷绫荤墿璐ㄧ瓑鏉傝川锛岃繖鏍峰姞澶т簡绾寲鐨勯毦搴︺傜（鏍锋椂鏈濂芥槸鍔犳恫姘紝纾ㄦ牱閫熷害瑕佸揩銆備竴鑸敤閰氬拰姘豢鎶芥彁涓ゆ锛屽惛鍙栦笂娓呮椂锛屼竴瀹氳灏忓績锛屼笉瑕佹妸鐧借壊鐗╄川鍚稿叆銆傛娊鎻愭椂涓嶈鏈夊お鍔涙尟鍔紝鎿嶄綔涔熻浠旂粏锛屽敖閲忛伩鍏DNA鏂銆傦紙浠呬緵鍙傝冿級
绛旓細涓180.50寰厠姣忔鍗囧埌305寰厠姣忔鍗囥傛牴鎹煡璇俊鎭樉绀猴紝鐢熺墿瀛﹀鐮旂┒鍙戠幇锛屽湪婵绱犲埡婵涓妞嶇墿缁嗚優鍐呮湁5绉嶄笉鍚岀殑DNA娴撳害閮芥湁鍓у銆侱NA鏄腑缁у寲瀛︾墿璐紝鎺у埗鐫铔嬬櫧璐ㄧ殑鍚堟垚骞朵娇涔嬪叿鏈塂NA鐨勯仐浼犲嵃璁颁綔鐢ㄣ
