求 怎样用紫外分光光度法测蛋白质含量 紫外分光光度法测定蛋白质

\u7d2b\u5916\u5206\u5149\u5149\u5ea6\u6cd5\u6d4b\u91cf\u86cb\u767d\u8d28\u7684\u542b\u91cf\u7684\u539f\u7406\uff1f

1\u7d2b\u5916\u5438\u6536\u5149\u8c31\u662f\u57fa\u4e8e\u7269\u8d28\u7684\u751f\u8272\u56e2\u548c\u52a9\u8272\u56e2\u7684\u7279\u6027\u5bf9\u7d2b\u5916\u5149\u8c31\u7684\u5438\u6536\uff0c\u53ef\u7528\u4e8e\u7269\u8d28\u7684\u9274\u5b9a\u548c\u7ed3\u6784\u5206\u6790.
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1、280nm的光吸收法

用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0 mg/mL。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白(BSA)。

2、280 nm和260 nm的吸收差法

核酸对紫外光有很强的吸收，在280 nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克)，但核酸在260 nm处的吸收更强，其吸收高峰在260 nm附近。核酸260 nm处的消光系数是280 nm处的2倍；而蛋白质则相反，其280 nm的紫外吸收值大于260 nm的吸收值。

3、215 nm与225 nm的吸收差法

蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280 nm的光吸收测定时，可用215nm与225 nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。

4、肽键测定法

蛋白质溶液在238 nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50～500 mg/mL已知浓度的5.0 mL蛋白质溶液，测定238 nm的光吸收值A238，以A238为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。

扩展资料：

紫外分光光度法原理

光谱法（spectrometry）是基于物质与电磁辐射作用时，测量由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度进行分析的方法。光谱法可分为发射光谱法、吸收光谱法、散射光谱法；或分为原子光谱法和分子光谱法；或分为能级谱，电子、振动、转动光谱，电子自旋及核自旋谱等。

分光光度法是光谱法的重要组成部分，是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。常用的技术包括紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、荧光分光光度法和原子吸收分光光度法等。

紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。

参考资料来源：百度百科-紫外分光光度法

四种紫外吸收法:
1. 280nm的光吸收法
用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0 mg/mL。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白(BSA)。
标准曲线的测定：
取6支试管，按下表编号并加入BSA(1.0 mg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，用蒸馏水补体积至5.0 mL；测定A280 ：用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵坐标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量(mg)为横坐标作图，标准曲线应为直线。
利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量。

2. 280 nm和260 nm的吸收差法
核酸对紫外光有很强的吸收，在280 nm处的吸收比蛋白质强10倍(每克)，但核酸在260 nm处的吸收更强，其吸收高峰在260 nm附近。核酸260 nm处的消光系数是280 nm处的2倍；而蛋白质则相反，其280 nm的紫外吸收值大于260 nm的吸收值。通常：
纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 ＝1.8
纯核酸的光吸收比值：A280/A260＝ 0.5
含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度=1.45×A280 － 0.74×A260 (mg/mL)

3. 215 nm与225 nm的吸收差法
蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280 nm的光吸收测定时，可用215nm与225 nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。
用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/mL的一系列5.0 mL的蛋白质溶液，分别测定215 nm和225 nm的吸光度值，并计算出吸收差:
吸收差D= A215 － A225
以吸收差D为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。

4. 肽键测定法
蛋白质溶液在238 nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50～500 mg/mL已知浓度的5.0 mL蛋白质溶液，测定238 nm的光吸收值A238，以A238为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。

用普通的紫外分光度法测蛋白质的含量即可。因为蛋白质中一般都含有芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸），而它们在近紫外区具有紫外吸收的性质，所以可以根据此原理测定蛋白质的浓度等。

只提醒下
因为核酸在260nm有最大吸收波长，所以要考虑到
蛋白质的是在280nm
你测定的时候要把260的和280波长的都测定
看他们的比值
进而确定样品的纯度
具体的方法 查生物化学实验书就有的

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