Guide to Fusion Tags

在许多情况下，你需要将你感兴趣的蛋白标记出来：比如你想观察某一个蛋白在细胞中的定位，或者对它进行结晶纯化。虽然市面上有很多抗体，但有时有些抗体很难特异性的靶向你想要的蛋白。为了解决这个困难，科学家们就研究除了一个分子工具：纯化标签。

纯化标签是一个已知蛋白，或者一个肽段，它可以融合进你感兴趣的蛋白。因为这些标签是很好识别的，所以有很多抗体可以选择，也非常容易进行检测。添加标签的方法主要是进行重组DNA，即将携带有你感兴趣的蛋白的编码DNA与标签整合在一起，将质粒转入细胞。当质粒被表达的时候，融合标签就会连接到你的蛋白上。

融合标签的选择非常重要，另外linker序列的选择也很重要，linker序列将你的蛋白连接到标签上，确保蛋白能够正确折叠，并具有正常的功能。

为什么要使用融合标签？
优点：
（1）分离蛋白，即使没有针对这个蛋白的特异的抗体
（2）在纯化之后，有必要的话需要切除融合标签
（3）同一个蛋白上可以接多个标签以用于多种用途
（4）避免在免疫沉淀过程中抗体干扰
（5）荧光标签可以用来在活细胞中观察蛋白

缺点：
（1）有些标签会影响蛋白质的功能
（2）需要进行标签位置的优化

这篇文章仅仅对各种标签进行介绍，但并不能说哪一种标签必须放置哪个位置上，完全取决于你的实验需要。

如果你不确定你的标签放在蛋白的哪个位置更好，那就需要多试几种方案，改变或增加一个蛋白酶位点，修饰linker序列，或者添加多个标签以用于不同用途。

目前有三种主要的融合标签类型：
表位标签：一般是短肽段序列，可用于免疫技术应用，比如WB，Co-IP。
亲和标签：一般比较长，可以用于蛋白纯化，或增加蛋白的溶解性。
荧光标签：可用于活细胞/死细胞中，一般是用于成像实验，比如细胞中定位和共表达实验。

具体到把融合标签放在蛋白的哪一端，完全取决于你要研究的蛋白：该蛋白如何折叠？哪一端是功能必须的？比如，如果C端是被折叠到蛋白的内部的，你就不会检测到融合标签的信号；或者你的蛋白在翻译后某一端会被切割，那么你的tag就会被切掉。

如果你不知道你的蛋白是如何折叠的，那么第一次做的时候，最好C端和N端都试试。有报道称与N末端标记的融合蛋白相比，C末端融合蛋白更能定位于预期的细胞区域。但是也并不完全如此。

不是所有的标签都是一样的：每一个标签都有自己的用途和限制。比如你需要让你的蛋白更加可溶，并且需要利用标签进行纯化。就可以使用串联亲和纯化（tandem affinity purification, TAP）来完成。TAP最初是指将特定的一系列的结构域融合到蛋白质上：钙调蛋白结合肽（CBP）和金黄色葡萄球菌的蛋白质A（ProtA），通过烟草刻蚀病毒（TEV）切割位点分开。然而，这个技术现在可以用来融合2-3个融合标签到蛋白上，但是通常仍然要包含一个TAP原始成分。这些标签可以融合到蛋白的一端，也可以融合到两端里。如果需要在使用后将标签切除，通常建议将标签串联。

His标签在TAP中被广泛使用，因为它非常小，对于纯化实验效率很高。它们通常与麦芽糖结合蛋白（MBP）一起使用，可增加溶解性。另一种经常使用的结合是GFP和His。

虽然TAP标签有很多优点，但是这个标签非常大，有可能破坏蛋白功能。另外，如果你使用含有CBP的标签，还可能与钙信号相互干扰。所以，尽可能少的在你的蛋白上添加标签。

有的小标签对蛋白的功能影响不大，但是某些大标签，可能会产生意想不到的影响。在这种情况下，通常在你检测完标签后，需要切掉你的标签。这就需要利用特异位点蛋白酶或者内含肽类来完成。

位点特异蛋白酶理论上不会影响你的蛋白功能。但是通常要在切割之后移除蛋白酶。一个解决方法是将蛋白酶和一个标签融合，通过亲和层析移除。几种蛋白酶识别位点的选择取决于你的需要。一个需要注意的点是，融合标签是在N端还是C端？从N端切割标签，留下的残余残基少，从C端切割标签，会留下4-6个多于的残基在你的蛋白上。下面列出了几种常用的蛋白酶位点（英文版，有需要的同学请自行查看）：

亲和标签之所以叫这个名字，是由于它们经常被用于亲和纯化。亲和纯化是从细胞裂解液里纯化蛋白的一项技术。见下图：

GST是一个由211个氨基酸组成的蛋白，分子大小约26KD。天然的GST可保护细胞对抗有害成分和氧化应激。GST的主要特点是其对三肽、谷胱甘肽亲和，可用来进行亲和层析。当含有GST的溶液通过以谷胱甘肽固定化的柱子时，GST就结合到谷胱甘肽上，从溶液中被分离出来。结合后，可用10mM谷胱甘肽洗脱下来。

需要注意的事项：
（1）污染：热激蛋白有时也会被GST洗脱下来。你可以通过SDS-PAGE胶看到这种污染。为了除去热激蛋白的污染，可以在纯化前用5mM 的氯化钙和5mM的ATP处理细胞裂解液。
（2）失去蛋白功能：由于GST是一个大标签，通常在溶液中作为二聚体存在。有可能会降低你的蛋白活性和功能。可以利用蛋白酶（比如thrombin, factor Xa或者PreScission）切割。

PolyHis标签由于其小体积、结合稳定，被广泛应用于蛋白纯化。虽然His标签可以有2-10个组氨酸残基，但最常用的是6×His Tag，或者hexatag。组氨酸与固定的过渡金属离子形成配位键，该性质可用于蛋白质纯化。 钴和锌柱可用于固定金属亲和色谱（IMAC），但通常使用镍柱。 因为His标签是短肽序列，所以标签的最佳位置根据蛋白质特异性来定，它们很少影响融合蛋白的性质。

需要注意的点：
（1）内源性的His: His残基广泛存在于哺乳动物和昆虫里，所以会有很高的背景信号。 背景结合可以通过利用5-10mM咪唑清洗来避免，但这会过早的洗脱掉你的蛋白。另外，在用His抗体检测时也应该注意背景结合。
（2）不建议将带有金属中心的蛋白质融合到His-tag上，因为金属可能会被亲和树脂吸收。
（3）应避免使用还原剂，例如二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇，因为它们会降低亲和性树脂。

Biotin,也叫做维生素H，是一个分子量244Da的小分子。通常被接在二抗上作为可视化技术，用于ELISA和WB。Biotin可与strptavidin和avidin分子形成非常牢固的结合，这个特点可以用来进行亲和纯化。由于Biotin是小分子，所以也不会影响蛋白的功能。另一个有价值的标签是Strep标签。 由于它的长度为8个氨基酸（WRHPQFGG），也不太会影响蛋白质功能，并且与生物素可逆地结合在同一pocket中。 这意味着可以使用strptavidin树脂有效纯化与Strep-tag融合的蛋白质，并在温和的缓冲液条件下使用生物素洗脱。

需要注意的点：
（1）四聚体与单体亲和性树脂：可以使用avidin包被的柱纯化生物素标记的蛋白，该柱可以四聚体或单体形式使用。 四聚体abidin色谱柱需要强力的变性剂，例如尿素或盐酸胍，用于洗脱过程，而单体树脂可以使用10mM生物素缓冲液进行较温和的洗脱。
（2）哺乳动物系统至少包含四种生物素化的蛋白质，会被与感兴趣的蛋白质共洗脱。 但是，很少会在大肠杆菌系统中遇到非特异性结合。

表位是抗原的一部分，是被抗体识别的那一部分。所以表位标签通常被用来进行以抗体为基础的分析实验。表位标签一般来说比亲和标签短，因此很少会影响蛋白质的功能。虽然它们也可以用来进行亲和纯化，但是基于免疫抗体的柱子造价昂贵，并且效率也不如亲和标签。然而，表位标签在检测方面有着非常大的优势。它被广泛的用于细胞培养和免疫共沉淀。

人类c-myc在增殖细胞中有较低的表达水平，并在人类肿瘤发生中起重要作用。c-myc标签是从c-myc基因的C-端衍生而来的，可以有效的被抗体识别。因此被广泛的应用于蛋白检测，例如WB，免疫共沉淀，流式。

需要注意的点：
（1）融合进分泌信号中：虽然c-myc标签可以被放在蛋白的N端或C端，但是不推荐把它融合进分泌信号通路里，它会影响分泌通路的定位。
（2）亲和纯化：虽然它也可用于蛋白纯化，但是很少用它。是因为洗脱要求在非常低的pH值条件下进行，会影响蛋白质功能。

人类流感病毒血凝素（HA）标签是从HA糖蛋白衍生而来的，HA糖蛋白存在于流感病毒表面，负责病毒的感染力。由于HA是一个小肽段标签，基本不会影响蛋白功能，可用于蛋白检测，比如ELISA，WB，免疫共沉淀。抗HA抗体也可以用于蛋白纯化。

要注意的点：
亲和纯化：不推荐使用HA标签标记凋亡细胞中的蛋白。HA标签会被caspase 3和caspase 7切割，会导致免疫反应性的降低。

DDDK或者FLAG，是唯一具有专利的标签（sigma），比其他的表位标签更亲水。必要的情况下，DDDK标签包含的肠激酶切割序列可以从融合的蛋白上切割掉标签。

需要注意的点：
亲和纯化：虽然抗DDDK抗体也可以有效的进行蛋白纯化，但是通常比其他的柱子要更加昂贵。

V5标签是由paramyxovirus simian病毒中P蛋白和V蛋白衍生而来的，V5标签有两种大小，9-14氨基酸。但是较长的是常用的。有时会将V5标签与His-tag结合使用。

需要注意的：
交叉反应：如果你使用的是哺乳动物表达系统，可能会出现交叉反应。

自从1992年，GFP基因被克隆出来，目前有许多的荧光标签可供使用。荧光标签的一个最大的优势就是non-toxic，因此可以被用于live cells。尽管荧光标签很大，对绝大部分的蛋白质功能影响很小。

虽然GFP的大小是26.9KD，是经常被使用的一个荧光标签，但是还有很多其它标签可供使用。

如果你准备使用多种荧光标签，一个非常重要的点是要选择不同的激发光和发射光的峰，如果发射峰重叠，就非常难以区分两种荧光。

通常，你希望使用可用光谱中最亮的荧光标签进行蛋白标记，从而能够获得清晰的信号并克服任何潜在的背景荧光。 亮度值（brightness value）是蛋白质的消光系数和量子产率的乘积。 但是，所得数字可能难以解释。 因此，一种常见的措施是将荧光标签的亮度与一个标准的标签做比较，例如和EGFP进行比较。

Maturation定义了荧光标记正确折叠、形成发色团和开始发射荧光的时间。在活细胞的time-sensitive事件中，一个短的maturation的时间至关重要。sfGFP为例，可以在10分钟内折叠，而mOrange通常要4个小时。

Bleaching是光稳定性的度量。即发色团在被激发后多长时间内失去发射光的能力。如果你打算进行一个长时间的延时实验，那么要考虑一个具有很高的光稳定性的标签。T-sapphire的bleaching半衰期是25秒，而EGFP则稳定的多，一般为174秒。

与大多数蛋白质一样，荧光标签受ph值、温度和氧气水平的影响。根据你所使用的条件，可能需要挑选合适的标签。

pH值可以影响激发和发射峰，并且大多数荧光标签对酸敏感。有些甚至可以在pH值变化时改变荧光强度（例如pHTomato）。pKa值是pH敏感性的一个很好的指标。

此外，温度和氧气水平都会影响Maturation时间。低氧条件往往会延迟maturation时间。然而，新的荧光标签，UnaG，即使在氧气水平很低的条件下也能发出荧光。

由于大多数荧光标签来自水母或者珊瑚蛋白，而不是哺乳动物的细胞或组织，可能使用的氨基酸密码子存在物种间差异，这可能导致表达水平低，信号弱。

幸运的是，许多较新版本的荧光标签都已经进行了密码子的优化，以便于在哺乳动物里得到很高的表达。因此在使用前，需要确认一下你的序列是否可以在目标系统里得到表达。

另一个非常重要的点是，要确定你的标签是单体还是二聚体（单体通常用“m”表示，如mCherry）。这会影响你的实验。很多早期的荧光标签容易形成寡聚体，可能会影响你的融合蛋白的功能。例如EGFP，是一种单体标签，但是在浓度很高的情况下，可以形成二聚体，它可以破坏亚细胞的细胞器或者破坏FRET这样的实验。

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