组织培养的步骤 组织培养的步骤是怎样的？
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配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。
自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。
1．配制几种母液
1．配制MS大量元素母液
一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。
分别称取
NH4NO3 165g KH2PO4 17g
KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g
MgSO4·7H2O 37g
各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
2．配制MS微量元素母液
一般将微量元素配制成100倍母液。
依次称取
KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g
H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g
MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g
ZnSO4·7H2O 0.86g
配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。
分别称取
CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g
各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。
3．配制MS有机母液
一般配制成100倍MS有机母液。
依次称取
肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g
烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g
盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g
配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
4．配制MS铁盐母液
一般配制成100倍MS铁盐母液。
依次称取
EDTA二钠3.73g FeSO4·7H2O2.78g
配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。
所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。
激素母液的配制
各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。
2．配制培养基
以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作：
1．先在烧杯中放入一些蒸馏水。
2．分别取上面八种母液10ml倒入。
3．一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。
4．加蒸馏水用量筒定溶至1L。
5．按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。
6．用精密试纸或酸度计调整PH至5.7～5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确） 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。
1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。
1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。
7．称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。
8．稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。
9．放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。
10．灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。
这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。
无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。
灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。
植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。
常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。
1．培养基用湿热灭菌
培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。
关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1～0.15MPa，20分钟。
按容器大小不同，保压时间有所不同，见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字，如果容器体积较大，但是放置的数量很少，也可以减少时间。 接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%～3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行搽洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行：
1．在接种4小时前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外线灯进行杀菌；
2．在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；
3．接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；
4．上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；
5．先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
6．接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；
7．接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。现将接种前后的程序连贯地介绍。
无菌接种步骤：
1．将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。
2．材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1～2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。
3．用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管口靠近酒精灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1～3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他尚无统一要求。接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。 培养指把培养材料放在培养室（无光、适宜温度、无菌）里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织，光照条件下进一步分化成再生植株的过程。
1．培养方法
1．固体培养法
即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。
2．液体培养法
即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50～100r/min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。
2．培养步骤
1．初代培养
初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某些外植体后，最初的几代培养。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。根据初代培养时发育的方向可分为：
1）顶芽和腋芽的发育
采用外源的细胞分裂素，可促进使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整小植株。一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型繁殖，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种的一种繁殖方式。
适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以。
茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。在实际操作中，采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便以及容易成活。
用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。
2）不定芽的发育
在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性（这与胚状体不同）。多数情况下它形成芽，后形成根。
另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。
在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。
3）体细胞胚状体的发生与发育
体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面产生，也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生。
4）初代培养外植体的褐变
外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接触外植体的培养。
褐变的主要原因如下：
a、植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。
b、生理状态由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般说来，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。
c、培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。
d、培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。
为了提高组织培养的成苗率，必须对外植体的褐变现象加以控制。可以采用以下措施防止、减轻褐变现象的发生。
1．选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。
2．合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。
3．使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外，使用0.1%～0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。
4．连续转移 对容易褐变的材料可间隔2～24小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7～10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。
(2)继代培养
在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不够，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。
继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株苗。
继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。培养基常是MS基本培养基；分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小。可先切成芽丛小块，放入MS培养基中，待到稍大时，再分离开来继续培养。
增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。
在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达到相当数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是储备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。
3．继代培养时材料的玻璃化
实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。
因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。
呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为：
a、增加培养基中的 溶质水平，以降低培养基的水势；
b、减少培养基中含氮化合物的用量；
c、增加光照
d、增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；
e、降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化现象发生；
f、降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。
3．生根培养
当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能及时将培养物转到生根培养基上去，就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。根培养是使无根苗生根的过程，这个过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。生根培养可采用1/2或者1/4MS培养基，全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素（NAA、IBA等）。
诱导生根可以采用下列方法
a、将新梢基部浸入50或100*10-6IBA溶液中处理4～8小时；
b、在含有生长素的培养基中培养4～6天
c、直接移入含有生长素的生根培养基中。
上述三种方法均能诱导新梢生根，但前两种方法对新生根的生长发育则更为有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。其原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。不过这种方法比较可行。
另外也可采用下列方法就可生根。1、延长在增殖培养基中的培养时间；2、有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量（即将增殖与生根合并为一步）；3、切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，此方法则没有生根阶段。可以省去一次培养基制作，切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些容易生根的作物。
另外少数植物生根比较困难时，则需要在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。
从胚状体发育成的小苗，常常有原先已分化的根，这种根可以不经诱导生根阶段而生长。但因经胚状体发育的苗数特别多，并且个体较小，所以也常需要一个低浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段，以便壮苗生根。
试管内生根壮苗的阶段，为了成功地将移植到试管外的环境中，以使试管苗适应外界的环境条件。通常不同植物的适宜驯化温度不同。如菊花，以18～20℃为宜。实践证明植物生长的温度过高不但会牵涉到蒸腾加强。而且还牵涉到菌类易滋生的问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活。春季低温时苗床可加设电热线，使基质温度略高于气温2～3℃，这不但有利于生根和促进根系发达，而且有利于提前成活。
移植到试管外的植物苗光强度应比移植前培养有所提高，并可适应强度较高的漫射光，（约4000lx左右），以维持光合作用所需光照强度。但光线过强刺激蒸腾加强，会使水分平衡的矛盾更尖锐。 试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。为了做好试管苗的移栽，应该选择合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个组织培养工作的顺利完成。
试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度近100%的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的小苗有着很大的差异。所以必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使她们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。
从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片上出现了大量的水孔，而且，气孔的数量、大小也往往超过普通苗。由此可知，试管苗更适合于高湿的环境生长，当将它们移栽到试管外环境时，试管苗失水率会很高，非常容易死亡。因此，为了改善试管苗的上述不良生理、形态特点，则必须经过与外界相适应的驯化处理，通常采取的措施有：对外界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等。
另外，对栽培驯化基质要进行灭菌是因为试管苗在无菌的环境中生长，对外界细菌、真菌的抵御能力极差。为了提高其成活率，在培养基质中可掺入75%的百菌清可湿性粉剂200～500倍液，以进行灭菌处理。
1．移栽用基质和容器
适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配时需按比例搭配，一般用珍珠岩、蛭石、草炭土或腐殖土比例为1：1：0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土为1：1。这些介质在使用前应高压灭菌。或用至少小时烘烤来消灭其中的微生物。要根据不同植物的栽培习性来进行配制，这样才能获得满意的栽培效果。以下介绍几种常见的试管苗栽培基质。
1．河砂
河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径为1～2mm。细砂即通常所说的面砂，其颗粒直径为0.1～0.2nm。河砂的特点是排水性强，但保水蓄肥能力较差，一般不单独用来直接栽种试管苗。
2．草炭土
草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成，其保水性好，蓄肥能力强，呈中性或微酸性反应，但通常不能单独用来栽种试管苗，宜与河砂等种类相互混合配成盆土而加以使用。
3．腐殖土
腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。一种是自然形成，一种是人为造成，人工制造时可将秋季的落叶收集起来，然后埋入坑中，灌水保湿的条件下使其风化，然后过筛即可获得。腐叶上含有大量的矿质营养、有机物质，它通常不能单独使用。掺有腐殖土的栽培基质有助于植株发根。
4．容器
栽培容器可用6×6cm～10×10cm的软塑料钵，也可用育苗盘。前者占地大，耗用大量基质，但幼苗不用移栽，后者需要二次移苗，但省空间、省基质。
2．移栽前的准备
移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2-3天，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗1-2天，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。
3．移栽和幼苗的管理
从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，应避免造成伤根。移植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度的环境中。保证空气湿度达90%以上。
1．保持小苗的水分供需平衡。在移栽后5～7天内，应给予较高的空气湿度条件，使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗水分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭设小拱棚，以减少水分的饿蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当5～7天后，发现小苗有生长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。约15天以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。
2．防止菌类滋生。由于试管苗原来的环境是无菌的，移出来以后难以保持完全无菌，因此，应尽量不使菌类大量滋生，以利成活。所以应对基质进行高压灭菌或鸿烤灭菌。可以适当使用一定浓度的杀菌剂以便有效的保护幼苗，如多菌灵、托布津，浓度800～1000倍，喷药宜7～10天一次。在移苗时尽量少伤苗，伤口过多，根损伤过多，都是造成死苗的原因。喷水时可加入0.1%的尿素，或用1/2MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生长与成活。
3．一定的温、光条件。试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是18～20℃，冬春季地温较低时，可用电热线来加温。温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。
另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。
4．保持基质适当的通气性。要选择适当的颗粒状基质，保证良好的通气作用。在管理过程中不要浇水过多，过多的水应迅速沥除，以利根系呼吸。
综上所述，试管苗在移栽的过程中，只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽的。
要根据培养目的适当选取材料，选择原则：易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。这一方
面要从健壮的植株上取材料，不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取
材料，决不要在雨天、阴天或露水未干时取材料。因为健壮的植株和晴天光合呼吸旺盛的组织，有自身消
毒作用，这种组织一般是无菌的。培养材料的消毒
从外界或室内选取的植物材料，
都不同程度地带有各种微生物。
这些污染源一旦带人培养基，
便会造成
培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上。
第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材
料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料
清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加
入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的
物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质
—
吐温。
第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、
70%
酒
精、消毒液、无菌水、手表等。用
70%
酒精浸
10
～
30s
。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，
加之
70%
酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花
蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用
70%
酒精处
理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取
1
—
2
种使用见表。第四步是用无菌
水涮洗，涮洗要每次
3min
左右，视采用的消毒液种类，涮洗
3-l0
次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂
杀伤植物细胞的副作用注意：①酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精
杀死植物细胞。②老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡
5
分钟。③升
汞的渗透力弱，一般浸泡
10
分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。④漂白粉容易导致植物材料失绿，所
以对于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入浓度为
0.08
—
0.12%
的吐温
20
或
80
（一种湿润剂），可以
降低植物材料表面的张力，
达到更好的消毒效果。
灭菌剂
使用浓度
(%)
持续时间
（
min
）
去除的难易
效
果
次氯酸钙
9~10 5~30
易
很好
次氯酸钠
2 5~30
易
很好
氯化汞
0.1~1 5~8
较难
最好
抗菌素
4~50mg/L 30~60
中
较好
制备外植体
将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，
叶片则不需剥皮。在操作中严禁用手触动材料。
接种和培养
（一）接种
在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种
1
－
2
个，以防止交叉污染。（二）封口
接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。
（三）温度
培养基大多应保持在
25
℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。
增殖
外植体的增殖是组培的关键阶段，
在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，
需要继代培养。
把材料分株或切
段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖
1
个月左右
后，可视情况进行再增殖。
根的诱导
继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，
必须转到生根培养基上进行生根培养。
1
个月后即可获得
键壮根系。
组培苗的炼苗移栽
试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，
先将培养容器打开，于室内自然光照下放
3
天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再
栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度
（相对湿度
98
％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。
组织培养中的清洗、消毒灭菌技术
日期：
2010
年
4
月
1
日
来源：互联网
作者：植物组培网
点击：
2190
1
、
清洗
植物组织培养用的各种玻璃器皿，
特别是培养瓶和盛培养基的器皿，
一定要严格清洗，
以防油污、
重金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内，影响培养物的生长。使用过的玻璃器皿应及时清洗，先将污
物如培养基、培养物倒掉，再浸入水中，然后洗涤。玻璃器皿的洗涤，可根据器皿的污染程度和性质，采
用不同的方法，通常有碱洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿，必须先进行高压消毒和煮沸，以杀死菌
体，否则会产生孢子飞扬，污染环境，给组织培养带来严重困难。器皿洗净后，应烘干或晾干，放在规定
的地方，便于取用。
常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热
(
烘烧和灼烧
)
、湿热
(
常压或高压蒸
煮
)
、射线处理
(
紫外线、超声波、微波
)
、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲
醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要
根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的
24h
内完成灭菌工序。高
压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅
内温度也随之增加。在
o
．
1MPa
的压力下，锅内温度达
121
℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细
菌及其高度耐热的芽孢。注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有
几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，
通电后，待压力上升到
O
．
05MPa
时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。三
次放气后，关阀再通电，压力表上升达
0
．
1-0
．
15Mpa
时，维持
15-20min
。
•
对高压灭菌后不变质的
物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，
既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。对于一些布制品，如实验
服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌
20-30min
。高压灭菌前后的培
养基，其
pH
值下降
0.2-0.3
单位。高压后培养基
pH
值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌
前用碱调高
pH
值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭
菌后的
pH
值变化幅度较大，甚至可大于
2
个
pH
值单位。环境
pH
值的变化大于
0.5
单位就有可能产生
明显的生理影响。
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，
从而改变培养基的渗透压。
在
8%-20%
蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高
0
．
43
倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使
15%-25%
的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于
5.5
，其水解量更多，培养基中添加
0.1%
活性炭
时，高压下蔗糖水解大大增强，添加
1%
活性炭，蔗糖水解率可达
5%
。
灼烧灭菌（用于无菌操作的器械
）
•
在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入
95%
的酒精中，使
用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用
250
或
500ml
的广口瓶，放入
95%
的酒精，以便插入工具。
干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌是利用烘箱加热到
160-180~C
的温度来杀死微生物。由
于在干热条件下，
细菌的营养细胞的抗热性大为提高，
接近芽抱的抗热水平，
通常采用
170
℃持续
90min
来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用
耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免
妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭
菌能源消耗太大，浪费时间。
过滤灭菌（不耐热的物质
）一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，
不能用高压灭菌处理，
通常采用过滤灭菌方法。
可用无菌的孔径
0.20-0.45um
的硝酸纤维素膜过滤菌类，
当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，
常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过
滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。
紫外线和熏蒸灭菌（空间）
•(1)
紫外线灭菌
在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭
菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成
死亡。紫外线的波长为
200
—
300nm
，其中以
260nm
的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的
能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过
1.2m
为宜。
(2)
熏蒸灭菌
用加热焚烧、
氧化等方法，
使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，
以杀死空气和物体表
面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭
紧密，按
5
—
8ml
／
m3
用量，将甲醛置于广口容器中，加
5g/m3
高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预
先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。化学消毒剂的种类很多，它们使微生物
的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。
一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所
以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和
酒精例外
专家解答
组织培养繁殖法是利用细胞的全能性和组织的再生能力，切取草莓植株的部分组织或器官，在无菌条件下，接种到人工配置的培养基上，使之发育成完整的植株。草莓组织培养繁殖的优点是：
（1）植株健壮结果好任何植物在长期的无性繁殖过程中都容易感染病毒，受到病毒感染的植株生活力衰退，产量降低，品质变劣。而组织培养繁殖的整个过程是在无菌环境中进行的，对于做繁殖材料的茎尖也要进行脱毒处理，这样所得的秧苗不含或少含病毒，比一般秧苗叶片大而厚，叶色浓绿；生长健壮且整齐一致；结果期延长3周，平均增产20%左右；果个大，品质优。
（2）繁殖速度快利用组织培养法繁殖草莓，一年内一个分生组织可获得几千株甚至几万株秧苗，这种繁殖方法对加速新品种推广，特别是对抽生匍匐茎低的品种的繁殖更为有利。
（3）繁殖不受季节限制组织培养是在操作室和配套温室中进行的，不受外界环境条件的影响，一年四季均可生产，在人工控制条件下，可进行工厂化育苗。
（4）节省土地，利于种质保存用组织培养法繁殖是在实验室中进行的，对露地占用少。所以，不仅节省土地，便于管理，而且对保存种质资源更加安全。
组织培养繁殖有以下几个步骤：
（1）配制培养基常用的培养基是MS培养基、怀特培养基，其配方见表11。
①配制母液。将营养成分中大量元素扩大10倍，微量元素扩大100倍。把大量元素、微量元素、有机生长物质分别贴上标签，放在3～5℃环境中待用。植物生长调节剂如6-苄基嘌呤、激动素用少量0.5摩尔/升的盐酸溶解，萘乙酸用酒精溶解，溶解后加水稀释。
②培养基配制。将所要用的琼脂加热溶解，加入蔗糖搅拌，配制成琼脂-蔗糖液。然后按量把配制好的母液置入准备好的容器中，接着把琼脂-蔗糖液也置入同一容器中，充分搅拌，定容到规定的体积。
③调整酸碱度。琼脂培养基加热灭菌时，pH会降低0.1～0.3，所以在加热前用0.1摩尔/升的盐酸或氢氧化钠液调整培养基的pH。
④高温消毒。把培养基趁热注入试管或三角瓶内，注入量为容器容积的1/3左右，塞上棉塞，缚紧，放入高压蒸汽锅内灭菌。蒸汽锅压力维持在78.5～98千帕，时间为10～20分钟。
单位：毫克/升序号化合物MSWhite1硝酸钾（KNO3）1900802硝酸铵（NH4NO3）1650-3四水硝酸钙[Ca（NO3）2·4H2O]-3004硫酸钠（Na2SO4）-2005七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）3707206七水磷酸二氢钠（NaH2PO4·7H2O）-16.57磷酸二氢钾（KH2PO4）170-8氯化钾（KCl）-659一水氯化钾（KCl·H2O）440-10四水硫酸锰（MnSO4·4H2O）22.37.011七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O）8.63.0表11营养基配方序号化合物MSWhite12硫酸铁[Fe2（SO4）3]-2.513五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）0.0250.00114氧化钼（MoO3）-0.00115硼酸（H3PO3）6.21.516碘化钾（KI）0.830.7517六水氯化亚钴（CoCl2·6H2O）0.025-18二水钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.25-19肌醇10010020烟酸0.50.321盐酸硫胺素0.40.122盐酸吡哆醇0.50.123甘氨酸2.0324蔗糖300002000025琼脂100001000026pH5.85.6表11营养基配方（续）-1（2）选材与消毒选取健壮植株上充实、小叶尚未展开的匍匐茎先端3厘米左右的幼嫩组织作培养材料。将材料用洁净流动的清水冲洗0.5～1个小时，然后用70%的酒精浸泡1分钟，再用0.1%升汞水浸泡7分钟，最后用无菌水冲洗2～3次。
（3）接种在无菌的超净工作台上，用镊子去掉茎尖组织的叶片，在解剖镜下，用消过毒的刀片切取茎尖分生组织0.3～0.5毫米大小，放入备用的培养基上。
（4）初代培养将接过种的试管或三角瓶放置在温度25～28℃，光照强度2000勒克斯，每天照射10小时的无菌条件下进行培养。10～15天接种物开始萌发，再经7～10天接种物产生很多小芽，形成芽丛；3个月后，无根苗长至3～4厘米。这时初代培养结束。
（5）继代培养当初代培养的无根苗长到3～4厘米时，将其取出进行生根培养。把剩下没达到3～4厘米的芽，按3～4个芽为一个芽丛重新分开，再重新植入同种培养基（初代培养基）上进行增殖培养，这种增殖培养称继代培养。1个月左右新的一批无根苗又繁殖出来，再用同种方法进行下一次继代培养。
（6）生根培养将初代培养或继代培养的高度已达到3～4厘米的无根苗，扦插到珍珠岩内进行生根培养。生根培养的苗床温度保持在18～20℃，空气湿度在80%以上，珍珠岩中要喷洒营养液和生根素。20天以后，当秧苗长出3～4条，长度达1.5～2.5厘米的根系时，可进行移栽锻炼。目前国内比较常用的营养液配方见表12。
化合物名称园试配方化合物用量毫克/升毫摩/升元素含量（毫克/升）大量元素总计（毫克/升）Ca（NO3）29454N112Ca160KNO38098N112K312NH4H2PO41534N18.7P41MgSO4.7H2O4932Mg48S64Na2Fe-EDTA20-Fe2.8H3BO32.86-B0.5MnSO4·4H2O2.13-Mn0.05ZnSO4·7H2O0.22-Zn0.05CuSO4·5H2O0.08-Cu0.02（NH4）6Mo7O24·4H2O0.02-Mo0.01N243P41K312Ca160Mg48S64表12营养液配方注：参引2001年张福墁主编《设施园艺学》。
（7）移栽当秧苗已长出3～4条1.5～2.5厘米长新根时，可移栽到室外进行土壤育苗。移栽后的前两周应覆盖薄膜与覆盖遮阳网，保持土壤和空气湿度，缓苗后撤除覆盖物。
提示板
组织培养能培育优质的壮苗，但技术要求比较严谨，目前还只在科研院所进行。随着科技的进步，大型繁育场将逐步得到推广。无毒育苗将是草莓苗木繁育的主要手段。
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