多糖类的分析方法 鉴定多糖的方法
\u591a\u7cd6\u7c7b\u7684\u8d28\u91cf\u7814\u7a76\u4e00\u822c\u6765\u8bb2\uff0c\u591a\u7cd6\u7684\u8d28\u91cf\u7814\u7a76\u4e3b\u8981\u5305\u62ec\u5404\u7ec4\u5206\u7684\u7406\u5316\u6027\u8d28\u5982\u6eb6\u89e3\u5ea6\u3001\u6bd4\u65cb\u5ea6\u548c\u7c98\u5ea6\u7684\u6d4b\u5b9a\uff0c\u5206\u5b50\u91cf\u53ca\u5206\u5b50\u91cf\u5206\u5e03\u7684\u7814\u7a76\uff0c\u5e73\u9762\u548c\u7acb\u4f53\u7684\u5316\u5b66\u7ed3\u6784\u5206\u6790\uff0c\u7ed3\u6784\u6539\u9020\u548c\u7ed3\u6784\u4fee\u9970\u7684\u7814\u7a76\uff0c\u4ee5\u53ca\u7cd6\u919b\u9178\u3001\u86cb\u767d\u8d28\u3001\u5355\u7cd6\u548c\u591a\u7cd6\u7684\u542b\u91cf\u6d4b\u5b9a\u7b49\u7b49\u3002\u4e0b\u9762\u7b80\u5355\u4ecb\u7ecd\u591a\u7cd6\u7684\u7ed3\u6784\u3001\u5206\u5b50\u91cf\u53ca\u5206\u5b50\u91cf\u5206\u5e03\u4ee5\u53ca\u542b\u91cf\u6d4b\u5b9a\u7b49\u65b9\u9762\u7684\u7814\u7a76\u8fdb\u5c55\u3002\u76ee\u524d\u5728\u591a\u7cd6\u4e00\u7ea7\u7ed3\u6784\u7684\u5206\u6790\u4e2d\u5927\u591a\u91c7\u7528\u5316\u5b66\u65b9\u6cd5\u4e0e\u7269\u7406\u65b9\u6cd5\u76f8\u7ed3\u5408\uff0c\u53ef\u57fa\u672c\u9610\u660e\u67d0\u4e00\u591a\u7cd6\u7684\u4e00\u7ea7\u7ed3\u6784\u7684\u5927\u81f4\u7279\u5f81\u3002\u800c\u76ee\u524d\u7528\u4e8e\u591a\u7cd6\u9ad8\u7ea7\u7ed3\u6784\u5206\u6790\u7684\u65b9\u6cd5\u4e3b\u8981\u662f\u7269\u7406\u65b9\u6cd5\uff0c\u8bf8\u5982 X-\u5c04\u7ebf\u7ea4\u7ef4\u884d\u5c04\u3001\u6838\u78c1\u5171\u632f\u3001\u7535\u5b50\u884d\u5c04\u7b49\u3002\u5982\u4e0a\u6240\u8ff0\uff0c\u591a\u7cd6\u7684\u4e00\u7ea7\u7ed3\u6784\u672c\u8eab\u5c31\u5f88\u590d\u6742\u3002\u7531\u4e8e\u591a\u7cd6\u7ed3\u6784\u7684\u5fae\u89c2\u4e0d\u5747\u4e00\u6027\uff0c\u6216\u7ed3\u6784\u952e\u4e2d\u6709\u7f3a\u9677\uff0c\u6216\u662f\u5206\u5b50\u91cf\u5206\u6563\uff0c\u4f7f\u591a\u7cd6\u7684\u4e00\u7ea7\u7ed3\u6784\u5206\u6790\u96be\u4ee5\u5f97\u51fa\u5b8c\u5168\u6b63\u786e\u7684\u7ed3\u6784\u5f0f\u3002\u591a\u7cd6\u7ed3\u6784\u7684\u63cf\u8ff0\u5305\u62ec\uff1a\u2460\u591a\u7cd6\u7684\u5206\u5b50\u91cf\u8303\u56f4\uff1b\u2461\u591a\u7cd6\u7684\u5355\u7cd6\u7ec4\u5206\uff1b\u2462\u5355\u7cd6\u7684\u8fde\u63a5\u70b9\u7c7b\u578b\uff1b\u2463\u5355\u7cd6\u548c\u7cd6\u82f7\u952e\u7684\u6784\u578b\uff1b\u2464\u91cd\u590d\u5355\u4f4d\u3002\u591a\u7cd6\u7684\u6d3b\u6027\u4e0e\u5176\u521d\u7ea7\u548c\u9ad8\u7ea7\u7ed3\u6784\u5bc6\u5207\u76f8\u5173\uff0c\u9ad8\u7ea7\u7ed3\u6784\u5728\u6d3b\u6027\u65b9\u9762\u6bd4\u4e00\u7ea7\u7ed3\u6784\u8d77\u66f4\u5927\u4f5c\u7528\u3002\u6709\u4e9b\u591a\u7cd6\u4e00\u7ea7\u7ed3\u6784\u76f8\u540c\uff0c\u4f46\u6d3b\u6027\u4e0d\u540c\uff0c\u5176\u539f\u56e0\u662f\u4e8c\u7ea7\u53ca\u4e09\u7ea7\u7ed3\u6784\u4e0d\u540c\u3002\u76ee\u524d\u591a\u7cd6\u7684\u7acb\u4f53\u7ed3\u6784\u7814\u7a76\u4e00\u822c\u9760 2D-NMR\u53caX-\u884d\u5c04\u6cd5\u3002\u9664\u6b64\u4e4b\u5916\uff0c\u591a\u7cd6\u7684\u6d3b\u6027\u8fd8\u4e0e\u5206\u5b50\u91cf\u3001\u6eb6\u89e3\u5ea6\u3001\u7c98\u5ea6\u7b49\u7406\u5316\u6027\u8d28\u6709\u5173\u3002\u5728\u7814\u7a76\u591a\u7cd6\u7684\u6784\u6548\u5173\u7cfb\u65f6\uff0c\u5e38\u7528\u5230\u591a\u7cd6\u7684\u5206\u5b50\u4fee\u9970\uff0c\u5bf9\u591a\u7cd6\u8fdb\u884c\u5316\u5b66\u4fee\u9970\uff0c\u5982\u786b\u9178\u5316\u3001\u8131\u786b\u9178\u5316\u3001\u5316\u5b66\u964d\u89e3\u3001\u9176\u964d\u89e3\u3001\u4e59\u9170\u5316\u3001\u70f7\u57fa\u5316\u7b49\u7b49\uff0c\u6709\u52a9\u4e8e\u6df1\u5165\u63a2\u8ba8\u5176\u6784\u6548\u5173\u7cfb\u3002
1\u3001\u65b9\u6cd5\u63d0\u8981
\u98df\u54c1\u4e2d\u76f8\u5bf9\u5206\u5b50\u8d28\u91cf>1\u00d7104\u7684\u9ad8\u5206\u5b50\u7269\u8d28\u572880%\u4e59\u9187\u6eb6\u6db2\u4e2d\u6c89\u6dc0\uff0c\u4e0e\u6c34\u6eb6\u6db2\u4e2d\u5355\u7cd6\u548c\u4f4e\u805a\u7cd6\u5206\u79bb\uff0c\u7528\u78b1\u6027\u4e8c\u4ef7\u94dc\u8bd5\u5242\u9009\u62e9\u6027\u5730\u4ece\u5176\u4ed6\u9ad8\u5206\u5b50\u7269\u8d28\u4e2d\u6c89\u6dc0\u5177\u6709\u8461\u805a\u7cd6\u7ed3\u6784\u7684\u591a\u7cd6\uff0c\u7528\u82ef\u915a-\u786b\u9178\u53cd\u5e94\u4ee5\u78b3\u6c34\u5316\u5408\u7269\u5f62\u5f0f\u6bd4\u8272\u6d4b\u5b9a\u5176\u542b\u91cf\uff0c\u5176\u663e\u8272\u5f3a\u5ea6\u4e0e\u7c97\u591a\u7cd6\u4e2d\u8461\u805a\u7cd6\u7684\u542b\u91cf\u6210\u6b63\u6bd4\uff0c\u4ee5\u6b64\u8ba1\u7b97\u98df\u54c1\u4e2d\u7c97\u591a\u7cd6\u542b\u91cf\u3002
2\u3001\u4e3b\u8981\u4eea\u5668
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3\u3001\u8bd5\u5242
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\uff084\uff09\u94dc\u8bd5\u5242\u6eb6\u6db2\uff1a\u53d6\u94dc\u8bd5\u5242\u50a8\u5907\u6db250mL\uff0c\u52a0\u6c3450mL\uff0c\u6df7\u5300\u540e\u52a0\u5165\u56fa\u4f53\u65e0\u6c34\u786b\u9178\u94a012.5g\u5e76\u4f7f\u5176\u6eb6\u89e3\u3002\u4e34\u7528\u65b0\u914d\u3002
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\uff086\uff09\u786b\u9178\u6eb6\u6db2\uff0810%\uff09\uff1a\u53d6100mL\u6d53\u786b\u9178\u52a0\u5165\u5230800mL\u5de6\u53f3\u6c34\u4e2d\uff0c\u6df7\u5300\uff0c\u51b7\u5374\u540e\u7a00\u91ca\u81f31L\u3002
\uff087\uff09\u82ef\u915a\u6eb6\u6db2\uff0850g/L\uff09\uff1a\u79f0\u53d6\u7cbe\u5236\u82ef\u915a5.0g\uff0c\u52a0\u6c34\u6eb6\u89e3\u5e76\u7a00\u91ca\u81f3100mL\uff0c\u6df7\u5300\u3002\u6eb6\u6db2\u7f6e\u51b0\u7bb1\u4e2d\u53ef\u4fdd\u5b581\u4e2a\u6708\u3002
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\uff089\uff09\u8461\u805a\u7cd6\u6807\u51c6\u4f7f\u7528\u6db2\uff1a\u5438\u53d6\u8461\u805a\u7cd6\u6807\u51c6\u50a8\u5907\u6db21.0mL\uff0c\u7f6e\u4e8e100mL\u5bb9\u91cf\u74f6\u4e2d\uff0c\u52a0\u6c34\u81f3\u523b\u5ea6\uff0c\u6df7\u5300\uff0c\u7f6e\u51b0\u7bb1\u4e2d\u4fdd\u5b58\u3002\u6b64\u6eb6\u6db21mL\u542b\u8461\u805a\u7cd60.10mg\u3002
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\uff081\uff09\u6837\u54c1\u5904\u7406\uff1a
a\u3001\u6c89\u6dc0\u7c97\u591a\u7cd6\uff1a\u51c6\u786e\u5438\u53d6\u6db2\u4f53\u6837\u54c15.0mL\uff0c\u7f6e\u4e8e50mL\u79bb\u5fc3\u7ba1\u4e2d\uff0c\u52a0\u5165\u65e0\u6c34\u4e59\u918720mL\uff0c\u6df7\u53005min\u540e\uff0c\u4ee53000r/min\u79bb\u5fc35min\uff0c\u5f03\u53bb\u4e0a\u6e05\u6db2\uff0c\u53cd\u590d\u64cd\u4f5c3~4\u6b21\u3002\u6b8b\u6e23\u7528\u6c34\u6eb6\u89e3\u5e76\u5b9a\u5bb9\u81f35.0mL\uff0c\u6df7\u5300\u540e\uff0c\u4f9b\u6c89\u6dc0\u8461\u805a\u7cd6\u3002
b\u3001\u6c89\u6dc0\u8461\u805a\u7cd6\uff1a\u51c6\u786e\u5438\u53d6b\u9879\u7ec8\u6eb6\u6db22mL\u7f6e\u4e8e20mL\u79bb\u5fc3\u7ba1\u4e2d\uff0c\u52a0\u5165100g/L\u6c22\u6c27\u5316\u94a0\u6eb6\u6db22.0mL\u94dc\u8bd5\u5242\u6eb6\u6db22.0mL\uff0c\u6cb8\u6c34\u6d74\u4e2d\u716e\u6cb82min\uff0c\u51b7\u5374\uff0c\u4ee53000r/min\u79bb\u5fc35min\uff0c\u5f03\u53bb\u4e0a\u6e05\u6db2\u3002\u6b8b\u6e23\u7528\u6d17\u6da4\u6db2\u6570\u6beb\u5347\u6d17\u6da4\uff0c\u79bb\u5fc3\u540e\u5f03\u53bb\u4e0a\u6e05\u6db2\uff0c\u53cd\u590d\u64cd\u4f5c3\u6b21\uff0c\u6b8b\u6e23\u752810%\uff08\u4f53\u79ef\u5206\u6570\uff09\u786b\u9178\u6eb6\u6db22.0mL\u6eb6\u6db2\u5e76\u8f6c\u79fb\u81f350mL\u5bb9\u91cf\u74f6\u4e2d\uff0c\u52a0\u6c34\u7a00\u91ca\u81f3\u523b\u5ea6\uff0c\u6df7\u5300\u3002\u6b64\u6eb6\u6db2\u4e3a\u6837\u54c1\u6d4b\u5b9a\u6db2\u3002
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\uff083\uff09\u6837\u54c1\u6d4b\u5b9a\uff1a\u51c6\u786e\u5438\u53d6\u6837\u54c1\u6d4b\u5b9a\u6db22.0mL\u7f6e\u4e8e25ml\u6bd4\u8272\u7ba1\u4e2d\uff0c\u52a0\u516550g/L\u82ef\u915a\u6eb6\u6db21.0mL\uff0c\u5728\u65cb\u8f6c\u6df7\u5300\u5668\u4e0a\u6df7\u5300\uff0c\u5c0f\u5fc3\u52a0\u5165\u6d53\u786b\u917810.0mL\u4e8e\u65cb\u8f6c\u6df7\u5300\u5668\u4e0a\u5c0f\u5fc3\u6df7\u5300\uff0c\u7f6e\u6cb8\u6c34\u6d74\u4e2d\u716e\u6cb82min\uff0c\u51b7\u5374\u81f3\u5ba4\u6e29\uff0c\u7528\u5206\u5149\u5149\u5ea6\u8ba1\u5728485nm\u6ce2\u957f\u5904\uff0c\u4ee5\u8bd5\u5242\u7a7a\u767d\u4e3a\u53c2\u6bd4\uff0c1cm\u6bd4\u8272\u76bf\u6d4b\u5b9a\u5438\u5149\u5ea6\u503c\u3002\u4ece\u6807\u51c6\u66f2\u7ebf\u4e0a\u67e5\u51fa\u8461\u805a\u7cd6\u542b\u91cf\uff0c\u8ba1\u7b97\u6837\u54c1\u4e2d\u7c97\u591a\u7cd6\u542b\u91cf\u3002\u540c\u65f6\u505a\u6837\u54c1\u7a7a\u767d\u5b9e\u9a8c\u3002
5\u3001\u7ed3\u679c\u8ba1\u7b97
(m1-m2)\u00d7V1\u00d7V3\u00d7V5 X= \u2014\u2014\u2014\u2014\u2014\u2014\u2014\u2014\u2014\u2014 m3\u00d7V2\u00d7V4\u00d7V6\u5f0f\u4e2d X\u2014\u6837\u54c1\u4e2d\u7c97\u591a\u7cd6\u542b\u91cf\uff08\u4ee5\u8461\u805a\u7cd6\u8ba1\uff09\uff08mg/g\uff09\uff1b
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6\u3001\u51c6\u786e\u5ea6\u4e0e\u7cbe\u5bc6\u5ea6\u5728\u4e0d\u540c\u98df\u54c1\u4e2d\u8fdb\u884c\u4e0d\u540c\u6d53\u5ea6\u7684\u52a0\u6807\u56de\u6536\u5b9e\u9a8c\uff0c\u56de\u6536\u7387\u4e3a87.8%~110.87%\uff0c\u4e0d\u540c\u5b9e\u9a8c\u5ba4\u5bf9\u540c\u4e00\u6837\u54c1\u8fdb\u884c10\u6b21\u6d4b\u5b9a\u7ed3\u679c\u7684\u76f8\u5bf9\u6807\u51c6\u504f\u5dee\u4e3a5.8%\u3002
下面将简单介绍化学方法和物理分析方法。⑴化学方法测定多糖结构还是目前最常用的方法，测定的手段很多，其中经典而有效的是甲基化分析、高碘酸氧化和Smith降解、部分酸水解以及乙酰解和甲醇解等。① 乙酰解：多糖的乙酰解反应是在由乙酸酐、乙酸和硫酸组成的混合液中加热进行的，在一定的糖苷键处裂解。研究表明，相同糖苷键在酸水解和乙酰解中的速度是不同的。乙酰解是酸水解的一种有用的补充，多糖可从这两种不同的方法中获得不同的片段，从不同的角度获得多糖的结构信息。甲醇解：多糖在80-100℃条件下与无水甲醇氯化氢反应能将多糖变成组成单糖的甲基糖苷，这些甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，然后进行GC分析并与标准单糖对照，可得到组成多糖的各单糖的定量数据。⑵物理分析法 ①IR法：IR在多糖结构分析上主要是确定吡喃糖的苷键构型，以及常规观察其他官能团。一般主要观察730-960cm-1的范围，如对于α-吡喃糖，δC1-H在 845 cm-1，而β-吡喃糖，δC1-H在890cm-1有最大吸收峰。②MS、GC-MS：GC分析多糖虽受样品挥发性和热稳定性的限制，但GC-MS是多糖结构分析不可缺少的工具，特别是对水解单糖、甲基化单糖及甲基化寡糖的分析，而且能鉴别出糖的异构体。MS在多糖结构分析中不仅在鉴别各种甲基衍生物的碎片，确定各种单糖残基的连接位置时必不可少，而且由于FAB-MS、ESI-MS和 MALDI-MS等技术的出现，利用质谱还可以测定多糖的分子量及一级结构。③NMR：用NMR技术研究多糖结构的一个特点是不破坏样品，对多糖的结构特征可通过化学位移、偶合常数、积分面积、NOE及驰豫时间等参数来表达。一维、二维图谱 NMR在分析糖的构型、相互连接的位置及顺序等方面具有广阔的应用前景。2、分子量及分子量分布多糖具有分子大小不均一的特点，近年来发现这些生物大分子的某一分子量范围成分具有药理活性，而另一分子量范围的成分不具有药理活性或具有一定的毒副作用，因此分子量及其分布既是这类药物的有效性控制的指标又是安全性控制的指标，质量标准中制订该项检查十分必要，这也是近年来大分子聚合物药物质量标准发展的一个明显的特点。多糖分子量只是代表相似链长的平均配布，不同方法所测得的分子量不同，即使是同一多糖，其重均分子量与数均分子量也相差较大，通常采用凝胶色谱法控制这类药物的分子量及其分布，应经研究选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂；使用的流动相通常为水或缓冲液，其pH值不应超过填充剂的耐受范围，可加入适量的有机溶剂，但浓度不应超过30%，流速以 0.5-1.0ml/min为宜，因这类分子多无紫外吸收，一般采用示差折光检测器，选用对照品的分子量范围及颗粒形状应与供试品匹配，测定数据经适宜的GPC软件处理求得相关参数。3、含量测定一般来讲，多糖不含蛋白和氨基酸，蛋白或氨基酸检测应呈阴性或符合限度检查要求，如为糖蛋白或糖肽，应提供其证据，以保证产品不是多糖与蛋白的混合物；并提供其氨基酸构成及蛋白含量范围，以保证质量稳定可控。对从天然植物中得到的多糖，在结构研究中尤其对糖组成分析，确定其中是否含有糖醛酸残基具有很重要的意义。糖醛酸的含量测定目前较常用的是硫酸咔唑法，但容易受中性糖残基的干扰。为了消除测定的干扰，可先测定样品中中性糖的吸收度，然后从样品的吸收度减去中性糖的吸收度，即为样品中糖醛酸的吸收度值。间羟基联苯法也是一种常用的多糖中糖醛酸含量测定方法，该法较硫酸咔唑法受中性糖残基的干扰更小。多糖的含量测定可分为两大类：一类是直接测定多糖本身，如高效液相色谱法和酶法；另一类是利用组成多糖的单糖缩合反应而建立的方法，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等。前者需要多糖的纯品和特定的酶，后者测定时方法学干扰较大，现有的比色重现性差，受影响因素多。但由于目前国内的实验条件，多糖的含量仍然主要采用这种方法，其原理为：多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖，单糖在强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物。在波长490nm左右处和一定浓度范围内，该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量，所用的单糖对照品尽量采用与其多糖组成一致或为含量较高的单糖，这样测得的值较准确。需要强调的是，这种方法所测定的是总糖的含量而不是总多糖的含量，因此首先应测定样品中游离的单糖含量，然后将总糖的含量减去游离单糖的含量，即为总多糖的含量。另外还可以采用3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法），它是在碱性条件下显色，较准确测定还原糖与总糖的含量从而求出多糖的含量，可消除还原性杂质的干扰。
多糖类的分析通常涉及到它们的分离、鉴定和定量，常用的方法主要包括以下几种：
1.高效液相色谱（HPLC）：
HPLC是分析多糖类常用的技术，特别适用于分离和定量分析。可以使用不同类型的色谱柱（如逆相、离子交换、凝胶渗透）来分离不同的多糖组分。
2.质谱法（MS）：
质谱分析，尤其是结合液相色谱的LC-MS，被广泛用于多糖的结构鉴定。MS可以提供有关多糖分子质量、糖单元组成和连接顺序的详细信息。
3.核磁共振（NMR）技术：
NMR可以提供关于多糖分子结构的详细信息，包括其单糖组成和糖苷键的类型。通过^1H和^13C NMR，可以获得多糖结构的详细信息。
4.红外光谱（IR）和拉曼光谱：
IR和拉曼光谱技术用于识别多糖中的功能团，如羟基、醛基等。这些技术对于理解多糖的化学结构特别有用。
5.酶联免疫吸附测定（ELISA）：
对于特定多糖的定量，ELISA可以提供高灵敏度和特异性。它通常用于生物样本中多糖的检测。
6.动态光散射（DLS）：
DLS可用于测量多糖在溶液中的粒径和分散性，有助于了解其物理性质。
以上这些方法各有优势和局限，根据多糖的性质和研究目的选择合适的方法至关重要。实验设计时通常需要考虑到样品的纯度、复杂度以及所需的信息详细程度。
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