叶绿素的紫外-可见吸收光谱 为什么叶绿素有选择吸收光谱的特性
"\u5bf9\u7740\u5149\u6e90\u89c2\u5bdf\u53f6\u7eff\u7d20\u63d0\u53d6\u6db2\u65f6,\u770b\u5230\u7684\u662f\u53f6\u7eff\u7d20\u7684\u5438\u6536\u5149\u8c31.\u6b63\u5bf9\u5149\u6e90\u548c\u80cc\u5bf9\u5149\u6e90\uff0c\u6539\u53d8\u7684\u5176\u5b9e\u662f\u4eba\u7684\u89c6\u89d2\u3002
\u6b63\u5bf9\u5149\u6e90\u7684\u65f6\u5019\uff0c\u523a\u6fc0\u4eba\u773c\u66f4\u591a\u7684\u5149\u6e90\u4ea7\u751f\u7684\u5149(\u5b83\u4eec\u7684\u6ce2\u957f\u96c6\u4e2d\u5728\u4eba\u89c6\u89c9\u654f\u611f\u8303\u56f4)\uff0c\u6240\u4ee5\u6b64\u65f6\u867d\u7136\u53f6\u7eff\u7d20\u63d0\u53d6\u6db2\u5728\u6563\u53d1\u7ea2\u5149\uff0c\u4f46\u4f60\u4e0d\u5bb9\u6613\u770b\u5230\u3002\u5c31\u597d\u6bd4\u4f60\u770b\u592a\u9633\u5149\uff0c\u5374\u89c2\u5bdf\u4e0d\u51fa\u5176\u4e2d\u7684\u7ea2\u5149\u6210\u5206\u3002
\u80cc\u5bf9\u5149\u6e90\uff0c\u80fd\u523a\u6fc0\u4eba\u773c\u7684\u5c31\u53ea\u6709\u53f6\u7eff\u7d20\u6563\u53d1\u7684\u7ea2\u5149\u4e86\uff0c\u5bb9\u6613\u8ba9\u4f60\u89c2\u5bdf\u5230\u800c\u5df2\u3002
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叶绿素含有2种呀，请看下面的叶绿素a在645nm和663nm 处均有吸收，在645nm处吸光系数较小，为16.75，在663nm 处较大，为82.04；叶绿素b 在645nm和663nm 处亦都有吸收，但在645nm处吸光系数较大，为45.60，在663nm 处较小，为9.27。由此可知：叶绿素a的吸收峰值出现在663nm 处，该吸收曲线延伸到645nm处，在此波长处的吸收系数不如在663 nm 处大，因此在计算公式中求算叶绿素a的含量时，需扣除叶绿素b在663nm和645nm 处的吸光度值，再进行计算。
标准分析方法要求，叶绿体色素提取液不可浑浊，在710nm或750nm波长下测量吸光度，其值应小于叶绿素a吸收峰的吸光度值的5％，否则应重新过滤。假定样品在663nm处的吸光度值为0.03，则在750nm处的吸光度值不得大于0.0015，对试液的清澈程度要求很高，测量710nm或750nm的目的是避免悬浮物质的干扰，一般测量水中的浑浊度所采用的波长为680nm，为避免在680nm处仍有叶绿素a产生的吸收值，故将测量浑浊度的波长选在710nm以上。在计算公式中，凡参与计算的各吸光度值都应减去710nm处的吸光度值，以扣除悬浮物质的干扰。
采用分光光度法测定叶绿素含量，对测量仪器分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差1nm，则叶绿素a的测定误差为2％，叶绿素b为19％，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素a和b来校正。
a．在叶绿素提取液中的红光吸收峰只有
662 am，叶绿素b的645 am 吸收峰不明显．这可
能是由于黄连翘叶片中叶绿素a和b的含量比约
为7：3，叶绿素b的吸收峰被掩盖在叶绿素a的
662 am强峰之下．
b．精测的2种叶绿素在蓝紫光区的吸收强度
都大于红光区，但用提取液测得的红光区吸光度
反而较大．这可能是wGD-6型光学多通道分析
仪测量范围的限制所致．
C．提取液中蓝紫光区的峰值位置与叶绿素a
和b的吸收峰位置均不一致，这是因为天然的植
物叶子不可避免地含有多种植物色素，多种成分
的植物色素的吸光性能叠加后，峰值点偏离了原
来位置．
把图4与表1中峰值比较，由于TU一
1800SPC型紫外一可见分光光度计的测量误差不
应达到2O am，笔者认为文献中的数据存在争议．
叶绿素b一丙酮溶液在435 am 处不存在吸收峰，
吸收峰应位于456 am 处．而且叶绿素a一丙酮溶
液的蓝紫光区吸收峰也不位于420 am，而应是
431 am．至于红光区的吸收峰，实测值与文献数
据相吻合．
1)用汞灯的发射光谱对光学多道分析仪定
标．用以定标的汞灯发射谱线数据如下：红光区
的定标起始波长为574 nm，定标发射谱线分别是
576．96 nm，578．97 nm和730．96 nm；蓝紫光区
的定标起始波长为400 nm，定标发射谱线分别是
404．67 nm，435．83 nm 和546．07 nm．
2)配制叶绿素提取液和参比溶液，对其进行
吸收光谱的测量(使用WGD-6型光学多通道分
析仪)．
本实验所用的叶片是黄连翘叶的新芽部分．
其叶绿素的提取方法是[5]：
a．取新鲜的、洗净擦干的黄连翘叶片0．5 g，
去中脉，剪碎后放人研钵中，加石英砂和碳酸钙粉
(少量)及2～3 mL 8O 丙酮(或95 乙醇)，冰浴
中研磨至组织变白，再加丙酮1O mL，研成匀浆，
暗处静置约10 min．
b．将提取液过滤到5O mL棕色容量瓶(或替
代物)中，用丙酮反复冲洗研钵与研棒数次，并用
少量丙酮反复冲洗滤纸和残渣，直至无绿色为止，
以使色素全部转移人容量瓶．最后用丙酮定容至
5O mL，摇匀，保存于暗处备用．
在进行光度测量时，使用参比溶液可以消除
由于吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来
的误差，并扣除干扰的影响．作为简化实验，我们
不采用显色剂，故参比溶液采用含有与待测溶液
相同摩尔浓度溶剂的无色溶液[1]．
3)把叶绿素晶体溶解在丙酮溶液中，对此溶
液进行吸收光谱的测量，比较所得结果(使用
TU一1800SPC型紫外一可见分光光度计)．
4 实验结果与讨论
各种光合色素在有机溶剂(包括8O 丙酮溶
液)中的吸收峰位置 如表1所示．表1 光合色素在有机溶剂中的吸收峰位置
叶绿素种类 峰值／nm
叶绿素a
叶绿素b
胡萝卜素
胡萝卜素
叶黄素
420，660
435，643
420．440．470
425，450。480
425．445．475
丙酮提取液中色素浓度计算公式 如下
C。一12．21A 663— 2．81A646
Cb一2O．13A646— 5．03A 663
， 、
CT— C。+ Cb一17．32A646— 7．18A663
Cx
．c一(1 O00A47o一3．27C。一1O4Cb)／229
式中 ，C ，CT分别为叶绿素a和b的浓度及叶
绿素总浓度，单位为mg·L_。；C ． 为类胡萝卜素
的总浓度，单位为mg·L_。；A 。，A ，A 。分别
是提取液在663 nm，646 nm，470 nm 下的吸光
度．
1)探测叶绿素提取液在整个可见光波段的吸
收曲线(使用WGD-6型光学多通道分析仪)
探测的结果见图2，图中纵坐标值的计算公
式为(适用于图2～4)．
= 100A = 1001n A = ln
式中J。( )是入射光通过8O 丙酮溶液后的光强
值，J( )是入射光通过叶绿素丙酮溶液后的光强
值，A是叶绿素在该波长的吸光度．
由图2可得出，在红光区，吸收峰位于
662．1 nm 处，该处的吸光度为A662—0．741 ．
蓝紫光区的吸收峰有3个：442．0 nm，458．6 nm
和474．5 nm，其中以474．5 nm 的吸光度最大，为
人八 ＼
380 420 460 500 540 580 620 660 700 740
／nm
图2 叶绿素提取液在可见光区(380~740 nm)的
吸收光谱A 474．
- - 0．574．(※表示2次测量值的平均数)
对照表1和式(1)的精确测量峰值表及各种
叶绿素含量的计算公式，笔者认为：
a．实测的662 nm 强吸收峰正是叶绿素a在
660 nm[3 (或663 nm[5 )的吸收峰，叶绿素b在
643 nm【3 (或646 nm[5 )的吸收峰在被测溶液中
没有被测量到．
b．吸收峰442．0 nm，458．6 nm，474．5 nm有
可能是a一胡萝卜素、D一胡萝卜素和叶黄素吸收峰
累加后的结果，其中442．0 nm，474．5 nm两峰与
Q一胡萝卜素的440 nm，470 nmL3 和叶黄素的
445nm，475nm[3 峰值比较一致．
C．由式(1)计算，实验用的黄连翘叶子的色素
含量如表2所示．
表2 黄连翘叶子中色素含量 mg／L-1
浓度 数值
C日
Cb
CT
Cx．
c
7．75
3．39
11．14
0．74
注：叶绿素a和b的含量比约为7：3
2)探测不同浓度的叶绿素提取液在吸收峰附
近的吸收曲线(使用WGD-6型光学多通道分析
仪)
为了测出叶绿素提取液的浓度对吸收峰的影
响，对不同浓度的叶绿素提取液在吸收峰附近的
吸收曲线进行了探测．假设提取液的起始浓度为
100 ，然后采用逐次稀释的方法测出浓度为
5O ，25 ，1O％时溶液的吸收曲线．
测得的2个主要吸收峰(662 nm和436 nm)
的吸光度随浓度变化的曲线见图3．可以看出，溶
液的浓度对吸收峰的波长几乎没有影响，光的吸
收与溶液浓度的关系遵从Lambert-Beer定律．
3)探测叶绿素晶体在可见光与近紫外光区的
吸收曲线(使用TU-1800SPC型紫外一可见分光光
度计)
为了将实验所得的曲线与标准值比较，使用
了叶绿素a(Fluka，纯度95 )和叶绿素b(Fluka，
纯度95 )配制的丙酮溶液进行测量，并将测得
的吸收曲线与提取液的吸收曲线进行了比较．
实验采用叶绿素a为0．24 mg(使用BP221D
叶绿素a只吸收少量绿光
绛旓細鍙︿竴涓槸娉㈤暱430~450nm鐨勮摑鍏夐儴鍒.鍙﹀鍙堕粍绱犲拰鑳¤悵鍗滅礌鐨鍚告敹鍏夎氨鍖轰负娉㈤暱400~500nm鐨勮摑鍏夐儴鍒嗭紝鍙堕粍绱犲拰鑳¤悵鍗滅礌鍚告敹钃濆厜鍚庢妸鑳介噺杞粰鍙剁豢绱杩涜鍏夊悎浣滅敤銆傚洜姝ゅ厜鍚堜綔鐢ㄨ兘澶熷埄鐢ㄧ殑涓昏鍏夎氨鍖烘槸娉㈤暱640~660nm鐨勭孩鍏夐儴鍒嗗拰娉㈤暱400~500nm鐨勮摑鍏夐儴鍒嗐绱绾垮鍏夊悎浣滅敤娌鏈変粈涔褰卞搷锛屼絾鏄兘澶熸姂鍒舵鐗╁緬闀裤
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