双分子荧光互补的BiFC技术的优缺点
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\u53cc\u5206\u5b50\u8367\u5149\u4e92\u8865(bimolecular fluorescence complementation\uff0cBiFC)\u5206\u6790\u6280\u672f\uff0c\u662f\u7531Hu\u7b49\u57282002\u5e74\u6700\u5148\u62a5\u9053\u7684\u4e00\u79cd\u76f4\u89c2\u3001\u5feb\u901f\u5730\u5224\u65ad\u76ee\u6807\u86cb\u767d\u5728\u6d3b\u7ec6\u80de\u4e2d\u7684\u5b9a\u4f4d\u548c\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u7684\u65b0\u6280\u672f.\u8be5\u6280\u672f\u5de7\u5999\u5730\u5c06\u8367\u5149\u86cb\u767d\u5206\u5b50\u7684\u4e24\u4e2a\u4e92\u8865\u7247\u6bb5\u5206\u522b\u4e0e\u76ee\u6807\u86cb\u767d\u878d\u5408\u8868\u8fbe\uff0c\u5982\u679c\u8367\u5149\u86cb\u767d\u6d3b\u6027\u6062\u590d\u5219\u8868\u660e\u4e24\u76ee\u6807\u86cb\u767d\u53d1\u751f\u4e86\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528.\u5176\u540e\u53d1\u5c55\u51fa\u7684\u591a\u8272\u8367\u5149\u4e92\u8865\u6280\u672f(multicolor BiFC)\uff0c\u4e0d\u4ec5\u80fd\u540c\u65f6\u68c0\u6d4b\u5230\u591a\u79cd\u86cb\u767d\u8d28\u590d\u5408\u4f53\u7684\u5f62\u6210\uff0c\u8fd8\u80fd\u591f\u5bf9\u4e0d\u540c\u86cb\u767d\u8d28\u95f4\u4ea7\u751f\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u7684\u5f3a\u5f31\u8fdb\u884c\u6bd4\u8f83.\u76ee\u524d\uff0c\u8be5\u6280\u672f\u5df2\u7528\u4e8e\u8f6c\u5f55\u56e0\u5b50\uff0cG\u86cb\u767d\u03b2\u03b3\u4e9a\u57fa\u7684\u4e8c\u805a\u4f53\u5f62\u5f0f\uff0c\u4e0d\u540c\u86cb\u767d\u8d28\u95f4\u4ea7\u751f\u76f8\u4e92\u4f5c\u7528\u5f3a\u5f31\u7684\u6bd4\u8f83\u4ee5\u53ca\u86cb\u767d\u8d28\u6cdb\u7d20\u5316\u7b49\u65b9\u9762\u7684\u7814\u7a76\u5de5\u4f5c\u4e0a.
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一项技术的优缺点体现在和其他不同技术的比较中。和其它多数技术相比，双分子荧光互补技术适用范围广，既可以用于体内也可以用于体外的蛋白质相互作用研究，是其优点之一。本文仅基于体内蛋白质相互作用来进行比较。用于体内蛋白质相互作用研究的技术有多种，其中酵母双杂交技术应用最为广泛。酵母双杂交技术不仅可以用于已知蛋白之间的相互作用，还能用其中1种蛋白去筛选与之相互作用的蛋白，但是这项技术仍然存在几个固有的不足:1)相互作用必须在酵母中进行，许多外源目标蛋白在酵母中表达天然活性已经发生变化;2)各种原因造成的假阳性，例如一些受试蛋白本身可能激活了报告基因的转录或在酵母双杂交系统中相互作用的蛋白在其天然环境中处于不同的细胞器，并不发生相互作用;3)必须通过酵母细胞培养才能观察到结果，耗时较长。与之相比，BiFC系统可以在细菌，真菌，以及真核细胞中实施，所研究的蛋白处于其天然的环境中，并且能够直观地报道蛋白质相互作用在细胞中的位置，即定位(localization研究，此外，BiFC技术耗时比较短。目前，研究体内蛋白质相互作用的主流方法是荧光能量共振转移技术(FRET)或生物发光能量共振转移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)。2种方法都要求供体荧光团的发射波谱和受体荧光团的激发波谱有一定程度的重叠，并且距离在10纳米以内，以及受体发射的荧光强度是在假定受体没有吸收其它的光能量而只吸收了供体处于激发态时转移的能量，而供体需获取有或无受体时发射的荧光强度，因此，FRET和BRET技术对仪器的要求高，需要复杂的数据分析。同时，这类方法检测的是供体和受体的荧光强度的变化。相比之下，BiFC系统对仪器要求低、数据处理相对简单，由于只是检测荧光的有无，因而背景干净，检测更加灵敏。其他蛋白质片段互补技术主要通过检测底物的变化来间接的反映蛋白质间的相互作用，不能确定蛋白质相互作用的位置。由于重建后的荧光蛋白结构较稳定，双分子荧光互补技术还可以用于研究蛋白质之间的弱相互作用或瞬间相互作用。 BiFC技术的最大缺陷是多个BiFC系统对温度敏感。温度高时，片段间不易互补形成完整的荧光蛋白。一般在30℃以下形成互补效应好，温度越低，越有利于片段之间的互补，这就对研究细胞在生理条件下的蛋白质相互作用带来不利因素。目前，只有基于venus、citrine和cerulean的3个双分子荧光互补系统可以在生理温度条件下实现片段互补。此外，BiFC系统需要2个荧光蛋白片段互补，重新形成完整的活性蛋白以及发生荧光蛋白自体催化过程，不同的BiFC系统往往需要几分钟到几小时完成该过程，因此观察到的双分子荧光信号滞后于蛋白质的相互作用过程，不能实时地观察蛋白的相互作用或蛋白复合物的形成过程。
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