自身引导合成法和置换合成法合成cDNA第二链的优缺点是什么？
在完成第一链cDNA合成后，得到的是DNA与RNA的杂交分子。通过DNA聚合酶的作用，利用第一链作为模板，开始第二链的合成过程。以下是三种主要方法：
1. 自身引导合成法
首先，通过变性降解去除杂交分子中的RNA，使得单链cDNA的3'端形成发夹结构作为引物。在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，这个引物引导第二链的合成。然而，这种方法存在一些缺点：S1核酸酶在切割发夹结构时，可能导致mRNA 5'端序列出现缺失和重排。此外，如果S1核酸酶纯度不足，可能破坏合成的双链cDNA分子。
2. 替换合成法
这种方法以第一链合成的产物cDNA和mRNA杂交体作为模板。RNA酶H在杂交体的mRNA链上切割，形成一系列RNA引物，接着在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下完成第二链的合成。其优点包括：效率高，可以直接利用第一链反应产物，无需额外纯化步骤，以及避免使用S1核酸酶对双链cDNA进行切割，从而减少了潜在的误差。
3. 引物-衔接头法
这种方法并未详述，但可能涉及使用特定的引物和衔接头策略来增加第二链合成的精确性和效率。
以上三种方法各有优缺点，选择哪种方法取决于实验的具体需求和条件。在实际操作中，需要根据实验目标和实验条件来权衡和优化cDNA第二链的合成策略。
扩展资料
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
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