志贺氏菌最简单的检验方法和收集方法100分! 有没有志贺氏菌在平板，TSI，血清学上的照片谢谢了，大神帮忙...
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实验六 食品中志贺氏菌的检验一,实验目的要求
1,了解食品的质量与志贺氏菌检验的意义.
2,掌握志贺氏菌的生物学特性.
3,掌握志贺氏菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断.
4,掌握志贺氏菌属血清学试方法.
5,掌握食品中志贺氏菌检验的方法和技术.
二,原理
志贺氏菌属(Shigella) 的细菌(通称痢疾杆菌),是细菌性痢疾的病原菌.临床上能引起痢疾症状的病原生物很多,有志贺氏菌,沙门氏菌,变形杆菌,大肠杆菌等,还有阿米巴原虫,鞭毛虫,以及病毒等均可引起人类痢疾,其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见.人类对痢疾杆菌有很高的易感性.在幼儿可引起急性中毒性菌痢,死亡率甚高.所以在食物和饮用水的卫生检验时,常以是否含有志贺氏作为指标.
志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别,为革兰氏阴性杆菌,长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m .不形成芽胞,无荚膜,无鞭毛,不运动,有菌毛.志贺氏菌属的主要鉴别特征为:无鞭毛,不运动,对各种糖的利用能力较差,并且在含糖的培养基内一般不产生气体.志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验.
三,试剂和仪器
(一)最先准备的器材
规格名称 数量 用途
1,500ml广口瓶 1个 稀释样品
2,500ml三角瓶 1个 制增菌液
3,250ml三角瓶 6个 制培养基
4,18×180mm试管 8支 制三糖铁培养基
5,13×100mm试管 40支 制蛋白胨水等
6,1ml移液管 2支
7,10ml移液管 2 支
8,直径为90 mm平皿 12套 制SS,EMB平板
9,250ml量筒 1支
(二)应灭菌的其它器材
剪刀1把 不锈钢汤匙1把 称量纸适量
(三)应准备的培养基和试剂
培养基总量 所用容器
GN 增菌液 225ml/瓶 1瓶 500ml三角瓶
EMB培养基 100ml/瓶 1瓶 250ml三角瓶
SS琼脂 100ml/瓶 1瓶 250ml三角瓶
三糖铁斜面 6ml/支 6支 15×150mm试管
葡萄糖半固体培养费基4ml/支 5支 13×100mm试管
蛋白胨水 2ml/支 5支 13×100mm试管
5%乳糖发酵管 3ml/支 5支 13×100mm试管
甘露醇发酵管 3ml/支 5支 13×100mm试管
棉子糖发酵管 3ml/支 5支 13×100mm试管
甘油发酵管 3ml/支 5支 13×100mm试管
兔血浆 3ml/支 1支 13×100mm试管
多价血清和26种因子血清
四,实验内容
样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分离→→生化学试验→→血清学试验鉴别→→结果报告
第一天 样品处理和增菌培养
(一),样品处理
无菌操作称取检样25g,加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内,固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎,粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化.
(二),增菌培养
放于36℃培养6～8h.
培养时间视细菌生长情况而定,当培养液出现轻微混浊时即应中止培养.
第二天 接种选择性平板进行分离培养
(一),接种选择性平板
取增菌液1环,划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个;另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和EMB(伊红美蓝)琼脂平板各1个.
(二),培养
放于36℃培养18～24h.
结果:志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落
第三天 初步生化试验
(一),接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体培养基
从SS,EMB琼脂平板,挑取平板上的可疑菌落,接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管.一般应多挑几个菌落,以防遗漏.经36℃培养18～24h,分别观察结果.
(二),培养
放于36℃培养18～24h.
结果:乳糖,蔗糖不发酵,葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体),无动力
可以弃去的培养物:
a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物;
b. 在18～24h内发酵乳糖,蔗糖的培养物;
c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物;
d. 产气的培养物;
e. 有动力的培养物;
f. 产生硫化氢的培养物.
第四天,血清学分型和进一步的生化试验
凡是乳糖,蔗糖不发酵,葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体),无动力的菌株,可做血清学分型和进一步的生化试验.
(一),血清学分型鉴定
从三糖铁琼脂上挑取培养物,做玻片凝集试验.
第1步,先用4种志贺氏菌多价血清检查,如果由于K抗原的存在而不出现凝集,应将菌液煮沸后再检查;
第2步,如果呈现凝集,则用A1,A2,B群多价和D群血清分别试验.
第3步,如系B群福氏志贺氏菌,则用群和型因子血清分别检查.
福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1.可先用群因子血清检查,再根据群因子血清出现凝集的结果,依次选用型因子血清检查.
第4步,4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株,可用鲍氏多价1,2,3分别检查,并进一步用1～15各型因子血清检查.如果鲍氏多价血清不凝集,可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清及各型因子血清检查.
表1 福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原
型和亚型
型抗原
群抗原
在群因子血清中的凝集
3,4
6
7,8
1a
Ⅰ
1,2,4,5,9……
+
-
-
1b
Ⅰ
1,2,4,5,9……
+
+
-
2a
Ⅱ
1,3,4……
+
-
-
2b
Ⅱ
1,7,8,9……
-
-
+
3a
Ⅲ
1,6,7,8,9……
-
+
+
3b
Ⅲ
1,3,4,6……
+
+
-
4a
Ⅳ
1,(3,4)……
(+)
-
-
4b
Ⅳ
1,3,4,6……
+
+
-
5a
Ⅴ
1,3,4……
+
-
-
5b
Ⅴ
1,5,7,9……
-
-
+
6
Ⅵ
1,2,(4)……
(+)
-
-
X
-
1,7,8,9……
-
-
+
Y
-
1,3,4……
+
-
-
注:+凝集;-不凝集;()有或无
(二),进一步的生化试验
已判定为志贺氏菌属的培养物,应进一步做5%乳糖发酵,甘露醇,棉子糖,甘油的发酵,靛基质试验.
接种生化培养基
从三糖铁琼脂上挑取培养物上,拌种到:
5%乳糖,甘露醇,棉子糖,甘油,靛基质培养基中
2,观察试验结果
志贺氏菌属4个生化群的培养物,应符合该群的生化特性.但福氏6型的生化特性与A群或C群相似,见表2.
表2 志贺氏菌属四个群的生化特性
生化群
5%乳糖发酵
甘露醇
棉子糖
甘油
靛基质
A群:痢疾志贺氏菌
-
-
-
(+)
-/+
B群:福氏志贺氏菌
-
+
+
-
(+)
C群:鲍氏志贺氏菌
-
+
-
(+)
-/+
D群:宋内氏志贺氏菌
+/(+)
+
+
d
-
注:+阳性;-阴性;-/+多数阴性,小数阳性;;(+)迟缓发酵;d有不同生化型
(三),结果报告:
综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告
五,思考题
1,如何提高志贺氏菌的检出率
2,志贺氏菌在三糖铁培养基上的反应结果如何 解释这些现象
3,志贺氏菌检验有哪5个基本步骤
4,食品中能否允许有个别志贺氏菌存在 为什么
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4 志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。DNA的G+C为49-53克分子%（Tm法）。
1 增菌培养：
宋内氏志贺氏菌的增菌培养；以无菌的手续称取样品25g放入事先加有0.5μg/mL新生霉素的250mL志贺氏菌肉汤中，将此混悬液于室温中静置10min并时时振摇之。将浸液倾入灭菌的500mL锥形瓶中，调整pH，必要时用1N NaOH或1NHCL调至pH7.2±0.2，再将此锥形瓶置于加有新鲜催化剂的厌氧缸中，放入 GasPak并加水使之活化。因此厌氧罐内部温度较高，每次用后皆应将催化剂加热。将厌氧罐置于44.0℃水浴中培养20h，振摇混悬液后划线接种于麦康凯氏琼脂平板。于35℃培养20h。
对其他志贺氏菌的增菌培养亦按上述方法进行。但加入新生霉素量为3μg/mL，并在厌氧环境下置42.0℃水浴培养。
志贺氏菌的分离
a.常规培养方法
检查麦康凯琼脂平板，志贺氏菌的菌落为浅粉红色，半透明，将此可疑菌落接种于下列培养基中：葡萄糖肉汤，TSI琼脂斜面，赖氨酸脱羧酶肉汤，动力试验琼脂和胰胨。置35℃培养48h，但应在20h进行检查，弃去所有有动力、产H2S、产气、赖氨酸脱羧以及发酵蔗糖与乳糖的培养物。关于产生吲哚者，应弃去其44℃增菌物中的阳性培养物。至于42℃增菌培养中的所有可疑培养物皆有可能是阳性或是阴性，因此皆应予保留。
b.生理学性状
将初筛反应良好的培养物再接种其他生化试验，志贺氏菌的特性概述如下分离：H2S、尿素酶、葡萄糖、（产气）运动、赖氨酸、脱羧酶、蔗糖、侧金盏花醇、乳糖（2日）、KCN、丙二酸盐、柠檬酸盐、与水杨素皆为阴性；甲基红为阳性。用抗血清鉴定其血清型或参照表二所列32个血清型的生物学特性进行试验。其粘液酸盐（mucate）和乙酸盐（acetate）的反应是会有所帮助的。在这些反应中志贺氏菌一般为阴性，而不产气的大肠杆菌一般至少在此反应中的一项为阳性。
c.血清学性状:
将犊牛肉浸汁琼脂斜面的24h培养物混悬于3mL0.85%生理盐水中,使其浓度相当于 标准比浊管第5号,在洁净的玻璃平皿上用蜡笔标记9个3x1cm的方块.按照以下方案滴加混悬液，抗血清与生理盐水。
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