我问师兄如何让蛋白纯度更高，他只告诉我这点……
硬核 | 细胞培养笔记如何精读一篇文献献给初学者：如何选择合适的荧光蛋白又被蛋白纯化折磨到哭泣，如果早知道这点就好了用 His-tag 做蛋白纯化时，或多或少有这样的经历：要么蛋白纯度低、纯化出来的蛋白失去原有结构，要么功能受到影响、难以从哺乳类细胞表达系统中纯化出目标蛋白。
作为一个孜孜不倦积极进取的人，我觉得在实验之前得先多做做功课，于是跑到隔壁实验室向师兄请教。师兄跟我说 Strep-tag 系统具有纯化过程温和，目标蛋白纯度高，且相容于多种表达系统的特性，愈来愈受到大众的欢迎。但是，对于 Strep-tag 这个纯化系统是怎么发展起来的，为什么蛋白纯度高，很多人可能不知道，而这点得从功能性抗体开始说起……
1.功能性抗体的出现
随着生物制药技术的发展，抗体也因此成为科学家研究的热门领域。但在 80 年代初，功能性抗体的表达一直是个问题，酵母表达系统中表达出来的蛋白只有部分具有功能，在其他的微生物表达系统中，也没有成功的先例。
一直到 80 年代末，一个具有功能性的 McPC603 抗体的 Fv 片段终于成功的在 E.coli 被中表达出来「1」。这一方法的出现，使得科学家能更快速的表达具有不同基因变异的抗体片段，并能对这些变异所引发功能改变进行检视。
2.抗体纯化不简单
将重组抗体片段表达出来之后，必须将此片段纯化出来，当时多以亲和层析法搭配目标抗体的抗血清（antiserum）进行蛋白纯化，但这一方法常常受到限制：在研究一个未知目标蛋白时，常出现没有抗血清或是相容抗体的情况，这严重影响了实验进度。为此，科学家尝试找出更有效的一步纯化法。
首先，他们考虑在重组蛋白上加入短肽标签（tag），当时市面上已有 myc、flag、KT3 epitope 等标签，但这些主要适用于侦测目标蛋白，纯化蛋白效果非常有限，或非常昂贵。
随着 His-tag 的问世，让固定化金属离子亲和层析法（Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC）纯化目标蛋白变为可能，这的确提高了蛋白纯化的效率。
但是His-tag 仅适用于纯化，无法用于侦测目标蛋白，而且使用His-tag 进行Fv 片段纯化时，高盐浓度常使得Fv 片段解离成两个单体（VL 及VH），难以保持抗体的功能性及正确结构「2」。
3.更高能的短肽标签呼之欲出
要解决这些问题，科学家需要找出一个具备以下功能的短肽标签：
能被融合到目标蛋白上，且不会影响蛋白功能 能直接以现有试剂侦测出来 与配体结合稳定、特异性高且容易控制经过一番搜索，发现链霉亲和素（Streptavidin）在特定情况下，能与不同短肽进行可逆性的结合，再加上其与生物素（biotin）极高的亲合力，且与背景蛋白的非特异性结合机率低，链霉亲和素已被应用在许多检测系统中，甚至能做为一个稳定的介质来固定蛋白。又因为链霉亲和素在不同溶液条件中稳定性好，较抗体来的高，所以能够重复被利用。
因此，90 年代初，科学家开始寻找一个能与链霉亲和素特异性结合的亲和标签「2」。
4.终于找到了第一代 Strep-tag 系统 Strep-tag vs Streptavidin
因先前已知可用E.coli 系统表达出具有功能性的Fv 片段来「1」，科学家又希望能确认标签是否会影响蛋白功能，所以选择了已知的D1.3 抗体Fv 片段做为实验模型，以便检测加上的短肽标签是否影响了这片段与其抗原结合的特性「3」。
接着，一连串能与链霉亲和素结合的标签被接到VH domain 上，大量筛选之后，得到了一个适用于进行一步纯化的Strep-tag（Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly -Gly）「3」，与生物素相比，Strep-tag 和链霉亲和素间的亲和力较低，因此可以使用生物素衍生物Diaminobiotin，进行在生理条件下的温和洗脱。又因整个纯化流程温和，含盐浓度低，纯化出来的 Fv 片段完整且功能不受影响「3」。
除此之外，这个标签还能被应用在 Western blot 或 ELISA 实验中，以链霉亲和素酶偶联物（Streptavidin-enzyme conjugates）来检测纯化出的 Fv 片段。后续测试了以 Strep-tag 来纯化抗体以外蛋白的可能性，证实了这个一步纯化系统可以被广泛使用在不同类型的蛋白上「3」。
5.因为不完美，所以有了第二代 Strep-tag II vs Strep-Tactin®
但 Strep-tag 仅能接在目标蛋白的 C 端，对于需将标签接在 N 端或是蛋白内部的实验，非常的不实用。因此科学家进一步优化了这个标签，便有了现在被广泛使用的 Strep-tag II（Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys）「4」。
但即便足以用于蛋白纯化，科学家对 Strep-tag II 与链霉亲和素的结合强度低这点仍不甚满意，因为在比较特殊的纯化条件中效率会受影响。于是进行了链霉亲和素的改造，发展出 Strep-Tactin®。
Strep-Tactin®:Strep-tag II 的亲和力较 Streptavidin:Strep-tag II 提升了近 100 倍，这个改变使得洗脱时需改用脱硫生物素（Desthiobiotin）「5」，但过程一样温合。这就是二代 Strep-tag 系统，在过去近 20 年间，逐渐被广泛应用于纯化或侦测蛋白质中，还甚至发展出细胞分离检测的方法「6」。
6.总觉得还能更好，一起看看第三代 Twin-Strep-tag vs Strep-Tactin®XT
即便亲和力已提升，在某些状况下，Strep-Tactin® 使用仍有所限制，尤其是在需要极高亲和力的应用之中，例如检测蛋白质间的交互作用、或是从目标蛋白浓度低的样本中进行纯化。
因此科学家利用总结合力（Avidity）的原理，将两个 Strep-tag II 以 linker 连接在一起：Twin-Strep-tag「7」。这一新标签的出现再度提升了目标蛋白与Strep-Tactin® 的链接强度，改善了低浓度样本纯化效果「8」，还能于抓取蛋白复合体、检视蛋白间的交互作用「7,9 」。
美中不足的是，Strep-Tactin® 在变性条件下并不稳定（例如：使用尿素时），无法进行纯化，且进行批量纯化时，即使搭配 Twin-Strep-tag，效果仍有改善的空间。为此，科学家再次改造了 Strep-Tactin®，得到与 Twin-Strep-tag 亲和力更上一层楼的 Strep-Tactin®XT（XT 意指 extreme tight）「10」。
经过这次的优化，科学家首次创造出一个纯化系统，其中标签与配体的键结力几近共价，但链结仍保持可逆（注：Strep-tag II 也能与Strep-Tactin®XT 结合）。因亲和力的增加，即使经过多次清洗步骤，蛋白也不会从 Strep-Tactin®XT 上解离，提高了目标蛋白的得率。
需注意的是，洗脱步骤必须使用生物素，但是整个纯化流程与前几代一样温合，纯度超过 95%，这就是最新一代 Strep-tag 系统。用Strep-Tactin®XT 来纯化时，得率及纯度都提高；且Twin-Strep-tag 搭配后还能用在Biacore 芯片「11,12」、微量滴定板或ELISA 中来固定蛋白，进行后续检测，是一个多用途的亲和标签系统。
参考文献
1.Skerra A & Plückthun A（1988）Science, 240, 1038-1041.
2.Schmidt TGM & Skerra A（1993）Protein Eng., 6, 109-122.
3.Schmidt TG & Skerra A（1994）J Chromatogr A., 676, 337-45.
4.Schmidt TG, Koepke J, Frank R & Skerra A（1996）J Mol Biol., 255, 753-66.
5.Voss A & Skerra（1997）Protein Eng., 10, 975-82.
6.Knabel M, Franz TJ, Schiemann M, Wulf A, Villmow B, Schmidt B, Bernhard H, Wagner H & Busch DH（2002）Nat Med., 8, 631-7
7.Junttila MR, Saarinen S, Schmidt T, Kast J, Westermarck J（2005）Proteomics, 5, 1199-203.
8.Schmidt TG, Batz L, Bo L, Carl U, Holzapfel G, Kiem K, Matulewicz K, Niermeier D, Schuchardt I & Stanar K（2013）Protein Expr Purif., 92, 54-61.
9.Ivanov KI,Bašić M,Varjosalo M &Mäkinen K（2014）JoVE, 86, 51536.
10.Carl U（2016）Poster session presented at: PEGS Bosten 2016.
11.Dintner S, Heermann R, Fang C, Jung K & Gebhard S（2014）J Biol Chem., 289, 27899-910.
12.Yeliseev A, Zoubak L, Schmidt TGM（2017）。 Protein Expr Purif., 131, 109-118.
作者：IBA
图片来源：IBA
题图来源：pexels
话题： Strep-tag 系统, 功能性抗体, 生物素, 短肽标签, 蛋白纯化, 链霉亲和素
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