在羟自由基清除能力实验中,为什么要探究实验药品最佳用量 羟基自由基清除测抗氧化活性的原理，各试剂的作用是什么？
\u81ea\u7531\u57fa\u6e05\u9664\u5b9e\u9a8c\u4e3a\u4ec0\u4e48\u9009\u62e9dpph\u548cabts\u4e2d\u6587\u540d\uff1a2,2-\u8054\u6c2e-\u4e8c(3-\u4e59\u57fa-\u82ef\u5e76\u567b\u5511-6-\u78fa\u9178)\u4e8c\u94f5\u76d0\u522b\u540d\uff1a2,2\u2019-\u8fde\u6c2e\u57fa-\u53cc-(3-\u4e59\u57fa\u82ef\u5e76\u4e8c\u6c22\u567b\u5511\u5549-6-\u78fa\u9178)\u5206\u5b50\u5f0f\uff1aC18H24N6O6S4\u5206\u5b50\u91cf\uff1a548.68ABTS\u6cd5\u662f\u4f7f\u7528\u6700\u5e7f\u6cdb\u7684\u95f4\u63a5\u68c0\u6d4b\u65b9\u6cd5\uff0c\u53ef\u7528\u4e8e\u4eb2\u6c34\u6027\u548c\u4eb2\u8102\u6027\u7269\u8d28\u6297\u6c27\u5316\u80fd\u529b\u6d4b\u5b9a\u3002ABTs\u7ecf\u6c27\u5316\u540e\u751f\u6210\u7a33\u5b9a\u7684\u84dd\u7eff\u8272\u9633\u79bb\u5b50\u81ea\u7531\u57faABTs+\u00b7\uff0c\u80fd\u6eb6\u4e8e\u6c34\u76f8\u6216\u9178\u6027\u4e59\u9187\u4ecb\u8d28\u4e2d\uff0c\u5728414\u3001645\u3001734\u548c815nm\u5904\u6709\u6700\u5927\u5438\u6536\u3002\u88ab\u6d4b\u7269\u8d28\u52a0\u5165ABTS+\u00b7\u6eb6\u6db2\u540e\uff0c\u6240\u542b\u6297\u6c27\u5316\u6210\u5206\u80fd\u4e0eABTs+\u00b7\u53d1\u751f\u53cd\u5e94\u800c\u4f7f\u53cd\u5e94\u4f53\u7cfb\u892a\u8272\u3002\u5728ABTs+\u00b7\u7684\u6700\u5927\u5438\u6536\u6ce2\u957f(\u4e00\u822c\u9009\u62e9734nm)\u68c0\u6d4b\u5438\u5149\u5ea6\u7684\u53d8\u5316\uff0c\u5e76\u4e0e6-\u7f9f\u57fa-2\uff0c5\uff0c7\uff0c8\uff0e\u56db\u7532\u57fa\u82ef\u5e76\u4e8c\u6c22\u5421\u5583-2\u4e00\u7fa7\u9178[\u7c7b\u4f3c\u4e8e\u2166\u7684\u6c34\u6eb6\u6027\u7269\u8d28]\u6807\u51c6\u5bf9\u7167\u4f53\u7cfb\u6bd4\u8f83\u5c31\u80fd\u6362\u7b97\u51fa\u88ab\u6d4b\u7269\u8d28\u603b\u7684\u6297\u6c27\u5316\u80fd\u529b(TEAC\u503c\uff0c\u5373\u6bcf\u5206\u5b50\u6297\u6c27\u5316\u7269\u8d28\u6355\u6349ABTS+\u00b7\u7684\u6570\u76ee)\u3002
\u5c31\u662f\u6297\u6c27\u5316\u5427
机体在代谢过程中产生多种自由基包括超氧阴离子自由基（O-2·）、羟自由基（·OH）及其活性衍生物H2O2等，其中以·OH化学性质最活泼。一定数量的氧自由基可为机体所用，但过多的氧自由基将作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子，造成细胞结构和功能受损，进而导致体内代谢紊乱引起疾病〔1～4〕。因此，自由基清除剂的合成及寻找成为当前医药研究的主要方向之一，而中药的天然、丰富及低毒更受人们的青睐。目前人们测定自由基清除剂清除羟自由基的方法有很多，其中邻二氮菲- Fe2+氧化法操作简单，设备要求不高，易于推广和应用。本实验对该方法进行了若干改良。1 材料与方法
1.1 试剂维生素C、邻二氮菲、硫酸亚铁铵、过氧化氢、磷酸二氢、无水乙醇和氢氧化钠
1.2 仪器752N紫外可见分光光度计,DK-600S三用恒温水浴箱. 1.3 方法以维生素C作为自由基清除剂，用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生的·OH。H2O2/Fe2+体系产生的·OH将邻二氮菲-Fe2+氧化为邻二氮菲-Fe3+，使邻二氮菲-Fe2+对536 nm波长的最大吸收减弱，A536明显降低。当反应体系中存在·OH清除剂时，此氧化过程受抑制，A536则降低不明显，并可通过A536值比较·OH清除剂的清除能力〔5〕。对该实验进行三个方面的改良：一是将反应环境由pH 7.4改为pH 4.5的酸性环境；二是将37℃保温时间由60 min改为30 min；三是测定吸光度的波长由536 nm改为510 nm。实验过程中分别在pH 7.4的磷酸缓冲液及pH 4.5乙酸-乙酸钠缓冲液的环境下进行对照实验；在保温5～60 min的时间范围内、536 nm和510 nm波长分别测定吸光度，比较两种pH条件下吸光度的差异。反应中依次加入邻二氮菲、缓冲液、自由基清除剂维生素C、Fe2+及H2O2为加药管；不加维生素C为氧化管；不加维生素C及H2O2为对照管。
1.4 统计学处理组间采用t检验，数据以±s表示。
2 结果
2.1 不同测定波长及不同pH环境下的比较从表1可以看出，邻二氮菲-Fe2+络合物的最大吸收波长为510 nm，而最佳酸碱环境为pH 4.5。表1 不同测定波长及不同pH环境下的比较(略）
2.2 不同保温时间及不同pH环境下的比较图1显示了pH 7.4时不同保温时间对A510的影响，对照管吸光度于15 min时达高峰，随后缓慢下降；而加药管和氧化管吸光度一开始便呈现急剧下降的趋势。图2显示了pH 4.5时不同保温时间对A510的影响，对照管吸光度于30 min时达高峰，此后处于基本稳定状态；加药管和氧化管吸光度均于30 min后才出现较明显的下降。
2.3 各管之间吸光度的变化值（ΔA）比较从表2可以看出，随着保温时间的延长，各管之间的ΔA逐渐加大，但pH 4.5时的ΔA加药管-氧化管，在30 min时最大，此后较为稳定。表2 各管之间吸光度的变化值（ΔA）比较（略）
3 讨论
实验表明，邻二氮菲-Fe2+络合物在酸性条件下（pH 4.5）比较稳定，有较高的吸光度，并且最大吸收波长为510nm。而保温时间也是实验中的一个重要环节，保温到某一时间时，各管的吸光度较大，同时各管之间的吸光度变化值（ΔA）也较大，有利于自由基清除剂的甑选。从实验中观察到，在pH 4.5的条件下，对照管保温到30 min有最大的吸收峰，加药管也有较大的吸光度，使加药管与氧化管之间ΔA（ΔA加药管-氧化管）达到最大，该值更能说明自由基清除剂的作用强弱，是判断自由基清除剂的重要指标，并且还能反映该方法的灵敏度。而在pH 7.4时，加药管和氧化管一开始便呈现急剧下降的趋势，虽然两管吸光度有所差异，但ΔA加药管-氧化管较pH 4.5时要小得多，不具有说服力，也降低了反应的灵敏度。综上所述，采用邻二氮菲- Fe2+氧化法衡量自由基清除剂的作用时，最佳反应条件为pH 4.5，测定波长为510 nm，37℃保温时间为30 min。
绛旓細鏈轰綋鍦ㄤ唬璋㈣繃绋嬩腑浜х敓澶氱鑷敱鍩哄寘鎷秴姘ч槾绂诲瓙鑷敱鍩猴紙O-2路锛夈缇熻嚜鐢卞熀锛埪稯H锛夊強鍏舵椿鎬ц鐢熺墿H2O2绛夛紝鍏朵腑浠ヂ稯H鍖栧鎬ц川鏈娲绘臣銆備竴瀹氭暟閲忕殑姘ц嚜鐢卞熀鍙负鏈轰綋鎵鐢紝浣嗚繃澶氱殑姘ц嚜鐢卞熀灏嗕綔鐢ㄤ簬浣撳唴铔嬬櫧璐ㄣ佹牳閰搞佽剛绫荤瓑鐢熺墿鍒嗗瓙锛岄犳垚缁嗚優缁撴瀯鍜屽姛鑳藉彈鎹燂紝杩涜屽鑷翠綋鍐呬唬璋㈢磰涔卞紩璧风柧鐥呫1锝4銆曘傚洜...
绛旓細鍦ㄧ緹鑷敱鍩烘竻闄ゅ疄楠屼腑鍔犲叆杩囨哀鍖栨阿鍚庡嚭鐜板ⅷ缁胯壊鐨勫師鍥犳湁锛1锛夎繃姘у寲姘笌浣撶郴鍐呯殑涓嶉ケ鍜屽弻閿弽搴銆2锛夎繃姘у寲姘笌浣撶郴鍐呯殑鏄撴哀鍖栧簳鐗╁弽搴斻3锛纰辨/閰告у垎瑙銆
绛旓細鑿茬綏鍟夌緹鑷敱鍩虹殑娲绘銆傝彶缃楀晧缇熻嚜鐢卞熀鍏锋湁楂樺害鐨勬哀鍖栬繕鍘熸椿鎬э紝鍙互鎹曟崏鍏朵粬鍒嗗瓙涓殑鑷敱鍩猴紝浠庤屼腑鍜屽畠浠殑娲绘э紝骞剁ǔ瀹氳嚜韬
绛旓細缇熻嚜鐢卞熀鏄竴绉嶆哀鍖栬兘鍔涘緢寮虹殑鑷敱鍩銆傜粨鏅剁传娉曟祴瀹歄H鑷敱鍩烘竻闄よ兘鍔涘熀鏈師鐞嗘槸寮曡█缇熻嚜鐢卞熀鏄竴绉嶆哀鍖栬兘鍔涘緢寮虹殑鑷敱鍩猴紝瀹规槗鍦版哀鍖栧悇绉嶆湁鏈虹墿鍜屾棤鏈虹墿锛屾槸閫犳垚鐢熺墿缁勭粐鑴傝川杩囨哀鍖栥佹牳閰告柇瑁傘佽泲鐧借川鍜屽绯栧垎瑙ｇ殑閲嶈娲汇侶2O鍙戠敓Fenton鍙嶅簲浜х敓OH锛孫H瀹规槗杩涙敾楂樼數瀛愪簯瀵嗗害鐐癸紝浼氫笌缁撴櫠绱腑鍏锋湁楂樼數瀛愪簯瀵...
绛旓細缇熷熀鑷敱鍩洪檷瑙ｆ槸涓绉嶉噸瑕佺殑姘村鐞嗘妧鏈紝鍙互闄嶈В璁稿鏈夋満姹℃煋鐗锛屼絾鏄瀹為獙涔熷瓨鍦ㄤ竴浜涢棶棰橈紝涓昏鍖呮嫭浠ヤ笅鍑犱釜鏂归潰锛氱緹鍩鸿嚜鐢卞熀鐨勭敓鎴愬拰瀵垮懡闂锛氱緹鍩鸿嚜鐢卞熀闇瑕侀氳繃鍏夊偓鍖栨垨娣诲姞姘у寲鍓傜瓑鏂规硶浜х敓锛屼絾鏄叾瀵垮懡寰堢煭锛屽鏄撲笌鍏朵粬鐗╄川鍙嶅簲锛屽洜姝ら渶瑕佸湪瀹為獙涓繚璇佸叾浜х敓鍜屽瓨鍦ㄧ殑鏉′欢銆傚弽搴旀潯浠舵帶鍒堕棶棰橈細缇熷熀鑷敱...
绛旓細鐢靛瓙杞Щ锛屽姞鎴愪互鍙婅劚姘缇熷熀鑷敱鍩(.OH)鏄竴绉嶉噸瑕佺殑娲绘ф哀锛屾槸鐢辨阿姘ф牴锛圤H-锛夊け鍘讳竴涓數瀛愬舰鎴愶紝瀹冩槸鑷劧鐣屼腑浠呮浜庢盁鐨勬哀鍖栧墏.鍦ㄤ汉浣撳唴缇熷熀鑷敱鍩虹殑鍚噺杈冨ぇ锛屽嵄瀹充篃鏈涓ラ噸.鐣寗銆佽憽钀勩佸潥鏋溿佽彍鑺便佸ぇ钂溿佹煔瀛愩佺嚂楹︾瓑椋熺墿鑳芥秷闄や竴鑸殑鑷敱鍩猴紝浣嗗缇熷熀鑷敱鍩轰綔鐢ㄤ笉鏄庢樉.鐩墠宸茬煡鑳芥湁鏁堟秷闄ょ緹鍩...
绛旓細缇熻嚜鐢卞熀娓呴櫎鐜囦笉鏄秺澶ц秺濂姐傛牴鎹煡璇㈢浉鍏宠祫鏂欐樉绀猴細缇熻嚜鐢卞熀娓呴櫎鐜囪秺浣庤秺濂斤紝鍥犱负鍒嗗瓙閲忚秺浣庯紝鍏惰嚜鐢卞熀娓呴櫎鐜囪秺楂橈紝鍥犳涓庢櫘閫氬垎瀛愰噺鐨勭幓灏块吀鐩告瘮锛屼綆浜10kDa鐨刴iniHA鐨勬姉姘у寲娲绘ф洿寮恒
绛旓細棣栧厛锛岀緹鑷敱鍩鏄凡鐭ユ渶寮虹殑姘у寲鍓傦紝瀹冨嚑涔庡彲浠ュ鎵鏈夌粏鑳炴垚鍒嗗彂鐢熷弽搴旓紝瀵规満浣撶殑鍗卞鏋佸ぇ銆傚畠鍙互鏀诲嚮鎵鏈夌粏鑳炵殑纾疯剛锛屼娇缁嗚優鑶滄崯浼わ紝涔熷彲浠ヤ笌DNA鍙嶅簲锛屽紩璧风粏鑳炵獊鍙樸傛敞鎰忥細瀹冨鎵鏈夌粏鑳為兘鏈変綔鐢紝瀹冨嵆鍙互娓呴櫎鍐滆嵂娈嬬暀锛屼篃鍙互瀵艰嚧缁嗚優鎹熶激锛岀敋鑷抽犳垚缁嗚優绐佸彉銆傚叾娆★紝缇熻嚜鐢卞熀鍖栧鎬ц川闈炲父娲昏穬锛屽叾鏀诲嚮瀵硅薄...
绛旓細鎹爺绌讹紝MT鐨缇熻嚜鐢卞熀娓呴櫎鏁堣兘鏄秴姘у寲鐗╂鍖栭叾锛圫OD锛夌殑10000鍊嶏紝姘鑷敱鍩烘竻闄よ兘鍔鍒欐槸璋疯儽鐢樿偨锛圕SH锛夌殑25鍊嶏紝瀹冨叿鏈夋樉钁楃殑鎶楁哀鍖栨椿鎬э紝鑳戒綔涓轰綋鍐呮姉姘у寲鍓傦紝瀵圭柧鐥呯殑棰勯槻鍜屾姷鎶楄捣鐫鍏抽敭浣滅敤銆傚煎緱娉ㄦ剰鐨勬槸锛孧T鍦ㄥ鎶楄緪灏勬柟闈篃鏄剧ず鍑洪噸瑕佷綔鐢ㄣ傜爺绌惰〃鏄庯紝鍙ｆ湇MT鑳藉寤堕暱灏忛紶鍦ㄩ伃鍙楀ぇ鍓傞噺鐢电杈愬皠鍚庣殑...
绛旓細缇熷熀鑷敱鍩(.OH)鏄竴绉嶉噸瑕佺殑娲绘ф哀,浠庡垎瀛愬紡涓婄湅鏄敱姘㈡哀鏍(OH-)澶卞幓涓涓數瀛愬舰鎴愩傜緹鍩鸿嚜鐢卞熀鍏锋湁鏋佸己鐨勫緱鐢靛瓙鑳藉姏涔熷氨鏄哀鍖鑳藉姏,姘у寲鐢典綅2.8v銆傛槸鑷劧鐣屼腑浠呮浜庢盁鐨勬哀鍖栧墏銆 鍒跺彇鏂规硶 鐢礔enton娉 宸ヨ壓涓婂皢Fe2+鍜孒2O2鐨勭粍鍚堢О涓篎enton璇曞墏銆傚畠鑳芥湁鏁堝湴姘у寲闄嶈В搴熸按涓殑鏈夋満姹℃煋鐗,鍏跺疄璐ㄦ槸H2O2鍦‵e2+鐨勫偓鍖...
