常用的蛋白质含量测定方法有哪些 蛋白质含量测定的基本方法有哪些
\u56fd\u5bb6\u6807\u51c6\u68c0\u6d4b\u86cb\u767d\u8d28\u542b\u91cf\u6d4b\u5b9a\u65b9\u6cd5\u86cb\u767d\u8d28\u542b\u91cf\u6d4b\u5b9a\u65b9\u6cd5\u5c31\u662f\u68c0\u6d4bN\u5143\u7d20\u7684\u542b\u91cf\uff0c\u50cf\u4e09\u805a\u6c30\u80fa\u7684\u95ee\u9898\uff0c\u5c31\u662f\u901a\u8fc7\u589e\u52a0N\u7684\u542b\u91cf\u4f7f\u201c\u86cb\u767d\u8d28\u201d\u542b\u91cf\u63d0\u9ad8\u7684\u3002
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\u5177\u4f53\u64cd\u4f5c\u6b65\u9aa4\u5982\u4e0b\uff1a
1.\u6837\u54c1\u5904\u7406
\u7cbe\u786e\u79f0\u91cf0.2-2.0g\u56fa\u4f53\u6837\u54c1\u62162-5g\u534a\u56fa\u4f53\u6837\u54c1\u6216\u5438\u653610-20ml\u6db2\u4f53\u6837\u54c1\uff08\u7ea630-40mg\u6c2e\u5f53\u91cf\uff09\u3002\u5c06\u5176\u8f6c\u79fb\u81f3\u5e72\u71e5\u7684100\u6beb\u5347\u6216500\u6beb\u5347\u6c2e\u6c14\u56fa\u5b9a\u74f6\u4e2d\uff0c\u52a0\u51650.2\u514b\u786b\u9178\u94dc\uff0c6\u514b\u786b\u9178\u94be\u548c20\u6beb\u5347\u786b\u9178\uff0c\u8f7b\u8f7b\u6447\u52a8\uff0c\u5728\u74f6\u53e3\u653e\u7f6e\u4e00\u4e2a\u5c0f\u6f0f\u6597\uff0c\u5c06\u74f6\u5b50\u503e\u659c\u77f3\u68c9\u7f51\u4e0a\u670945\u5ea6\u89d2\uff0c\u6709\u5c0f\u5b54\u3002
\u52a0\u70ed\u5c0f\u706b\u540e\uff0c\u5185\u5bb9\u7269\u78b3\u5316\uff0c\u6ce1\u6cab\u5b8c\u5168\u505c\u6b62\uff0c\u52a0\u5f3a\u706b\u529b\uff0c\u4fdd\u6301\u74f6\u5185\u6db2\u4f53\u7a0d\u5fae\u6cb8\u817e\uff0c\u76f4\u81f3\u6db2\u4f53\u5448\u84dd\u7eff\u8272\u6f84\u6e05\u900f\u660e\uff0c\u7136\u540e\u7ee7\u7eed\u52a0\u70ed0.5\u5c0f\u65f6\u3002\u53d6\u51fa\u5e76\u51b7\u5374\uff0c\u5c0f\u5fc3\u52a0\u516520\u6beb\u5347\u6c34\uff0c\u51b7\u5374\uff0c\u79fb\u5165100\u6beb\u5347\u5bb9\u91cf\u74f6\u4e2d\uff0c\u7528\u5c11\u91cf\u6c34\u6d17\u51c0\u6c2e\u6c14\u74f6\uff0c\u6d17\u51c0\u6db2\u653e\u5165\u5bb9\u91cf\u74f6\u4e2d\uff0c\u7136\u540e\u7528\u6c34\u51b2\u6d17\u81f3\u523b\u5ea6\uff0c\u6df7\u5300\u5907\u7528\u3002
\u53d6\u76f8\u540c\u91cf\u7684\u786b\u9178\u94dc\uff0c\u786b\u9178\u94be\u548c\u6d53\u786b\u9178\u4f5c\u4e3a\u8bd5\u5242\u8fdb\u884c\u7a7a\u767d\u8bd5\u9a8c\u3002\u7136\u800c\uff0c\u8fd9\u79cd\u65b9\u6cd5\u5f88\u5371\u9669\uff0c\u5f88\u96be\u5728\u5b9e\u9a8c\u5ba4\u4e2d\u8bc1\u660e\u3002\u5927\u591a\u6570\u5b9e\u9a8c\u5ba4\u90fd\u6709\u4e00\u4e2a\u6d88\u5316\u5668\uff0c\u53ef\u4ee5\u4e00\u6b21\u5904\u740616\u4e2a\u4ee5\u4e0a\u7684\u6837\u54c1\u548c\u4e00\u4e2a\u53ef\u4ee5\u81ea\u884c\u8bbe\u5b9a\u6e29\u5ea6\u7684\u547c\u5438\u673a\u3002\u5b83\u66f4\u5b89\u5168\uff0c\u66f4\u53ef\u64cd\u4f5c\u3002
2.\u88c5\u597d\u5b9a\u6c2e\u88c5\u7f6e
\u6839\u636e\u9644\u56fe\u5b89\u88c5\u6c2e\u56fa\u5b9a\u88c5\u7f6e\u3002 \u5728\u7ea62/3\u7684\u6c34\u84b8\u6c14\u53d1\u751f\u5668\u4e2d\u52a0\u5165\u51e0\u6ef4\u7532\u57fa\u7ea2\u6307\u793a\u5242\u548c\u51e0\u6beb\u5347\u786b\u9178\u4ee5\u4fdd\u6301\u6c34\u5448\u9178\u6027\u3002 \u6dfb\u52a0\u51e0\u4e2a\u73bb\u7483\u73e0\u4ee5\u9632\u6b62\u7a81\u7136\u6cb8\u817e\u3002 \u84b8\u6c7d\u53d1\u751f\u74f6\u4e2d\u7684\u6c34\u7531\u538b\u529b\u8c03\u8282\u5668\u52a0\u70ed\u3002
3.\u5411\u63a5\u6536\u74f6\u5185\u52a0\u5165\u8bd5\u5242
\u5c0610ml 2\uff05\u787c\u9178\u6eb6\u6db2\u548c\u4e00\u6ef4\u6df7\u5408\u6307\u793a\u5242\u52a0\u5165\u5230\u63a5\u6536\u74f6\u4e2d\uff0c\u5e76\u5c06\u51b7\u51dd\u7ba1\u7684\u4e0b\u7aef\u63d2\u5165\u6db2\u9762\u4e0b\u3002\u5c0610.0ml\u6837\u54c1\u6d88\u5316\u6db2\u4ece\u5c0f\u73bb\u7483\u5438\u6536\u5230\u53cd\u5e94\u5ba4\u4e2d\uff0c\u752810ml\u6c34\u6d17\u6da4\u5c0f\u70e7\u676f\u4ee5\u6d41\u5165\u53cd\u5e94\u5ba4\uff0c\u5e76\u62e7\u7d27\u5c0f\u73bb\u7483\u68d2\u73bb\u7483\u585e\u3002
\u5c0610ml 40\uff05\u6c22\u6c27\u5316\u94a0\u6eb6\u6db2\u5012\u5165\u5c0f\u73bb\u7483\u676f\u4e2d\uff0c\u62ac\u8d77\u73bb\u7483\u585e\u4f7f\u5176\u7f13\u6162\u6d41\u5165\u53cd\u5e94\u5ba4\uff0c\u4e0d\u80fd\u7acb\u5373\u5c06\u73bb\u7483\u76d6\u585e\u7d27\uff0c\u8fd9\u6837\u5bb9\u6613\u4f7f\u73bb\u7483\u585e\u7c98\u5728\u6837\u54c1\u5165\u53e3\u5904\uff0c\u5e94\u5148\u7528\u84b8\u998f\u6c34\u6e05\u6d17\u7136\u540e\u76d6\u4e0a\uff0c\u5e76\u5728\u5c0f\u73bb\u7483\u676f\u4e2d\u52a0\u6c34\u4ee5\u9632\u6b62\u6cc4\u6f0f\u3002
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\u6269\u5c55\u8d44\u6599
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\u5206\u5149\u5149\u5ea6\u6cd5
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\u71c3\u70e7\u6cd5
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pro\u7684\u6d4b\u5b9a\u65b9\u6cd5\u5206\u4e3a\u4e24\u5927\u7c7b\uff1a\u4e00\u7c7b\u662f\u5229\u7528pro\u7684\u5171\u6027\uff0c\u5373\u542b\u6c2e\u91cf\uff0c\u80bd\u94fe\u548c\u6298\u5c04\u7387\u6d4b\u5b9apro\u542b\u91cf\uff0c\u53e6\u4e00\u7c7b\u662f\u5229\u7528\u86cb\u767d\u8d28\u4e2d\u7279\u5b9a\u6c28\u57fa\u9178\u6b8b\u57fa\u3001\u9178\u3001\u78b1\u6027\u57fa\u56e2\u548c\u82b3\u9999\u57fa\u56e2\u6d4b\u5b9apro\u542b\u91cf\u3002\u4f46\u662f\u98df\u54c1\u79cd\u7c7b\u5f88\u591a\uff0c\u98df\u54c1\u4e2dpro\u542b\u91cf\u53c8\u4e0d\u540c\uff0c\u7279\u522b\u662f\u5176\u4ed6\u6210\u5206\uff0c\u5982\u78b3\u6c34\u5316\u5408\u7269\uff0c\u8102\u80aa\u548c\u7ef4\u751f\u7d20\u7684\u5e72\u6270\u6210\u5206\u5f88\u591a\uff0c\u56e0\u6b64pro\u7684\u6d4b\u5b9a\u901a\u5e38\u5229\u7528\u7ecf\u5178\u7684\u5240\u6c0f\u5b9a\u6c2e\u6cd5\u662f\u7531\u6837\u54c1\u6d88\u5316\u6210\u94f5\u76d0\u84b8\u998f\uff0c\u7528\u6807\u51c6\u9178\u6db2\u5438\u6536\uff0c\u7528\u6807\u51c6\u9178\u6216\u78b1\u6db2\u6ef4\u5b9a\uff0c\u7531\u6837\u54c1\u4e2d\u542b\u6c2e\u91cf\u8ba1\u7b97\u51fapro\u7684\u542b\u91cf\u3002\u7531\u4e8e\u98df\u54c1\u4e2dpro\u542b\u91cf\u4e0d\u540c\u53c8\u5206\u4e3a\u51ef\u6c0f\u5b9a\u6c2e\u5e38\u91cf\u6cd5\u3001\u534a\u5fae\u91cf\u6cd5\u548c\u5fae\u91cf\u6cd5\uff0c\u4f46\u5b83\u4eec\u7684\u57fa\u672c\u539f\u7406\u90fd\u662f\u4e00\u6837\u7684\u3002
①凯氏定氮法原理：蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法
原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+， Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
⑤色素结合法（Bradford 法）
直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。
间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procedure，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。
它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度Lowry法相似。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。
⑦胶体金测定法
胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。
⑧其他方法
有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属。
测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。常见的方法有：凯氏定氮法、双缩脲法、酚试剂法及紫外吸收法。
1.凯氏定氮法
准备4个50mL凯氏烧瓶并标号，想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化，之后进行蒸馏，全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。
2.双缩脲法
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色， Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。首先利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线，将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合，并用只加入硫酸钠不含血清的试管作为对照，将两支试管加入等量的双缩脲试剂，充分混合后于37℃环境中放置10分钟，在540nm波长进行比色，以对照管调零，读取吸光度值，由标准曲线上直接查出蛋白质含量。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。
3.酚试剂法
取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值
4.紫外吸收法
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。
5.其他
除了以上介绍的方法之外，考马斯亮蓝法、二喹啉甲酸法等均可用于蛋白质测定。
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