酵母双杂交，bait如何构建 酵母双杂交法的原理？
\u505a\u5361\u74e6\u65af\u7528\u4ec0\u4e48\u9175\u6bcd?\u7528\u7684\u662f\u4e73\u9178\u83cc\u548c\u9175\u6bcd\u83cc\u590d\u5408\u53d1\u9175\u7684\u5662\uff01
\u9175\u6bcd\u53cc\u6742\u4ea4\uff1a\u771f\u6838\u751f\u7269\u8c03\u63a7\u8f6c\u5f55\u8d77\u59cb\u8fc7\u7a0b\u7684\u8ba4\u8bc6
1） 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时(过夜)，
OD600 达到1.2 左右。
2） 将此3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPD 中培养4 小时左右，使
培养液OD600 达到0.6。
3） 50ml 离心管收集菌液(Falcon, BD)，Eppendorf Centrifuge 5810R, 700g (1，
865rpm)，5 分钟离心收集菌体，弃上清。
4） 20ml ddH2O 重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R，700g，5 分钟离心收
集菌体，弃上清。
5） 20ml 1XTE/LiAc*重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R ，700g，5 分钟离
心收集菌体，弃上清。
6） 根据每个转化需要50μl 菌液的量加入1XTE/LiAc 重悬菌体，分装到
Eppendorf 管中，每管50μl 菌液。
7） 每管加约100ng Bait 基因质粒，5μl 预变性的Carrier DNA*，500μl 1X
TE/LiAc/PEG*。
8） 放置于30℃培养箱或者水浴中孵育30 分钟,15 分钟时混匀一次。
9） 30 分钟后，每管加入15μl DMSO(DIMETHYL SULFOXIDE)，轻轻上下颠
Bait 基因的自激活检测
一般采用膜检的方法，检测LacZ 基因的表达情况。膜检方法如下:
1) 将阳性克隆菌落影印于滤纸上。
2) 将滤纸完全浸于液氮中，时间长于30 秒，取出后晾干。
3) 培养皿加入适量显色液*(新鲜配制)，垫一层滤纸，让其完全湿润，将冻溶
后的滤纸铺在上面，使显色液渗透到表层。9cm 培养皿加2ml 显色液，15cm
培养皿加5ml 显色液。
4) 盖上皿盖，放置在37℃培养箱中，避光放置。
5) 20 分钟后开始观察有无变蓝的阳性结果并记录，一般以3 小时为准，特殊情
况下可以看过夜是否变蓝。
6)反应过后打开皿盖，将滤纸烘干，保存并记录。
35cycles
gtyvgfygyi
绛旓細閰垫瘝鍙屾潅浜娉曠殑鍘熺悊锛氬吀鍨嬬殑鐪熸牳鐢熺墿杞綍鍥犲瓙锛 濡侴AL4銆丟CN4銆佺瓑閮藉惈鏈変簩涓笉鍚岀殑缁撴瀯鍩燂細 DNA缁撳悎缁撴瀯鍩(DNA-binding domain)鍜岃浆褰曟縺娲荤粨鏋勫煙(transcription-activating domain)銆傚墠鑰呭彲璇嗗埆DNA涓婄殑鐗瑰紓搴忓垪锛 骞朵娇杞綍婵娲荤粨鏋勫煙瀹氫綅浜庢墍璋冭妭鐨勫熀鍥犵殑涓婃父锛 杞綍婵娲荤粨鏋勫煙鍙悓杞綍澶嶅悎浣撶殑鍏朵粬鎴愬垎...
绛旓細1锛4 閰垫瘝鍙屾潅浜鍏辫浆鍖栧疄楠屾寜閰垫瘝鎿嶄綔鎵嬪唽 寤鸿鐨勬柟娉曡繘琛岃浆鍖栵紝鍙栦笉鍚岄噺鐨勪笂杩颁袱绉嶆柟娉曟彁 鍙栫殑pGBKT7鈥053鍜宲GADT7锛嶵璐ㄧ矑鍏辫浆鍖栧埌AH109 閰垫瘝鑿屾牚涓紝灏嗚浆鍖栧ソ鐨勭粏鑳炴寜鐓1锛10銆1锛100銆1锛10003绉嶄笉鍚屾祿搴︾█閲婏紝鐒跺悗鍙100 閾轰簬SD锛 Trp锛忎竴Leu骞虫澘涓婏紝寰呴暱鍑哄厠闅嗗悗璁＄畻鐢熼暱鍏嬮殕鏁扮洰 (cfu)銆
绛旓細杩戝勾鏉ワ紝寮濮嬪嚭鐜颁簡搴旂敤閰垫瘝鍙屾潅浜鎶鏈繘琛 鐥呮瘨鍙椾綋鐮旂┒鐨勬垚鍔熸姤鍛婏紝濡傞夯鐤圭梾姣掔殑缁掔尨缁嗚優 鍙椾綋[30]銆傛潕鍑屼簯绛鏋勫缓浜嗚〃杈锯滅寧鐗┾濓紙prey锛夎泲鐧 鐨勮川绮掑拰琛ㄨ揪鐥呮瘨VAP鈥滆楗碘濓紙bait锛夎泲鐧界殑璐ㄧ矑锛岀劧鍚庡叡杞煋鍚屼竴閰垫瘝缁嗚優锛屽埄鐢ㄥ凡寤虹珛鐨勬槗鎰熺粏鑳 cDNA鏂囧簱锛岀瓫鍒颁簡闃虫у厠闅嗐傞叺姣嶅弻鏉備氦鎶鏈殑浼樼偣鏄伒鏁忓害楂...
绛旓細灏忛厤浣-鍙椾綋鐩镐簰浣滅敤鏄敓鐗╁涓澶氬熀鏈繃绋嬬殑鍩虹锛屼篃鏄尰瀛︿笂瀵逛汉绫荤柧鐥呰繘琛岃嵂鐗╁共棰勭殑鍩虹銆傛垜浠湪姝ゆ姤閬撲簡涓绉嶉仐浼犵郴缁燂紝绉颁负閰垫瘝涓夋潅浜ょ郴缁燂紝鐢ㄤ簬妫娴嬩綋鍐呴厤浣-鍙椾綋鐨勭浉浜掍綔鐢ㄣ傝绯荤粺鏀圭紪鑷閰垫瘝鍙屾潅浜绯荤粺锛屽叾涓粨鍚堜簡绗笁绉嶅悎鎴愭潅浜ら厤浣擄紝浠ュ湴濉炵背鏉惧拰FK506鍏变环杩炴帴鐨勫紓婧愪簩鑱氫綋浣滀负鏉傚悎閰嶄綋锛岄獙璇佷簡璇...
绛旓細1.閰垫瘝鑿鍙屾潅浜绯荤粺鏄埄鐢ㄥ湪閰垫瘝鑿岀殑鍚屼竴缁嗚優涓叡鍚岃〃杈句笉鍚岃泲鐧借川锛屼互閴村畾铔嬬櫧璐ㄤ箣闂寸浉浜掍綔鐢ㄧ殑涓绉嶅垎鏋愭柟娉曘傝繖鏄洰鍓嶇敤浜庨壌瀹氶櫎鑶滆泲鐧戒互澶栫湡鏍哥敓鐗╄泲鐧借川鐩镐簰浣滅敤鐨勬渶濂戒綋绯汇傚熀鏈濊矾锛1. 灏嗘姤鍛婂熀鍥爌8op-LacZ杞寲閰垫瘝EGY48鑿屾牚锛岀敤鍩瑰吇鍩篠D/-Ura绛涢夈2. 鍚屾椂鏋勫缓DNA鏂囧簱锛屽苟绾寲瓒冲鐨勮川绮掍互杞寲...
绛旓細閭ｄ箞,濡備綍瀵硅繖涓棶棰樿繘琛岀爺绌跺憿?杩欓噷鐙楀摜灏卞甫澶у绠鍗曟⒊鐞嗕竴涓嬪父鐢ㄧ殑铔嬬櫧璐ㄧ浉浜掍綔鐢ㄧ殑鐮旂┒鏂规硶銆傚浘1銆愪竴銆閰垫瘝鍙屾潅浜,Yeasttwo hybrid(Y2H), 杩欐槸涓涓彜鑰佺殑鎶鏈,Stanley Fields 鍜 Ok-KyuSong 鍦 1989 骞寸殑鏃跺欏埄鐢ㄥぇ鑲犳潌鑿屼腑 GAL4 涔崇硸鎿嶇旱瀛愮殑鍘熺悊,寮鍙戝嚭杩欎釜鏂规硶鐢ㄤ簬妫娴嬭泲鐧借川涔嬮棿鐨勭浉浜掍綔鐢 銆侴AL4 鎿嶇旱瀛...
绛旓細HTU+X?LacZ)铻嶅悎鑿屾牚鐨勫缓绔嬪皬閲忓垎姝ヨ浆鍖栨硶灏嗗凡缁鏋勫缓鐨Bait璐ㄧ矑pLexA?HERPUD1鍏ㄩ儴杞寲EGY48(p8op?LacZ)鍌ㄥ寰呯敤銆2005.2,MATCHMAKER LexA閰垫瘝鍙屾潅浜绯荤粺,閰垫瘝SD鍩瑰吇鍩,SD/, SD/,5:2005?05,鐢靛瓙淇＄:[email protected]绁炵粡鍏冭湣鏍疯剛瑜愯川娌夌Н鐥 (neuronal ceroid lipofuscinoses,鍏跺畠鍖栧璇曞墏鍧囦负鍥藉唴璐拱銆傛祴搴...
绛旓細2.鎻愬彇mRNA鏋勫缓杞綍鍥犲瓙cDNA鏂囧簱,骞跺皢鏂囧簱涓庨叺姣嶆縺娲诲洜瀛愯瀺鍚堢浉杩,鏋勫缓鈥淧rey鈥濇枃搴撱傛妸甯︽湁鏂囧簱鐨勮川绮掕浆鍏ュ埌姝ラ1鐨勯叺姣嶄腑銆 3.鏉′欢绛涢夌敓闀閰垫瘝,濡傛灉TF涓嶵FBS鏈夌粨鍚,鍗虫姤鍛婂熀鍥犲彲浠ラ『鍒╄〃杈俱 鍥5.閰垫瘝鍗鏉備氦鎶鏈師鐞 3.2.2.2PICh瀹為獙 PICh,鍙堣绉颁负鍙嶅悜ChIP瀹為獙,瀹為檯鏄氳繃鍒嗙鐨勬劅鍏磋叮DNA鐗囨瀵岄泦杞綍鍥犲瓙,鏈缁...
绛旓細3璇曠畝杩板湪澶ц偁鏉嗚弻涓,Lac operon鏄濡備綍璋冭妭鍏剁洰鐨勫熀鍥犵殑琛ㄨ揪,鏈夊摢浜涗富瑕佺殑椤哄紡鍙婂弽寮忓厓浠跺弬涓庢鍩哄洜琛ㄨ揪璋冭妭鐨勫弽搴,鏍规嵁鍏朵綔鐢ㄧ殑鏈虹悊,璇峰垪鍑烘墍鏈変綘鑳芥兂璞¤兘鐮村潖Lac operon璋冭妭鐨勭獊鍙樸4璇风畝杩閰垫瘝鍙屾潅浜鐨勫疄楠岃璁″強浣滅敤鏈虹悊,鍏朵富瑕佺殑搴旂敤鐩殑涓轰綍?姝ゅ疄楠屾妧鏈富瑕佺獊鐜颁簡杞綍鍥犲瓙缁撴瀯鍙婂姛鑳戒笂鐨勪綍绉嶇壒鎬?涓嬮潰鐢ㄨ嫳鏂囧洖绛...
