酵母双杂交筛库步骤
答：备注1:该酵母文库可以选择增加均一化处理步骤,我们使用DSN法均一化方法,可以构建出高质量的均一化酵母杂交文库,可以大大减少后续酵母筛选的工作量和筛选效率等。 客户构建指定的酵母双杂交cDNA文库,由客户提供组织、细胞或总RNA给我们即可: 细胞样本:细胞数量大于1*10^7 动物样本:大于1g 植物样本:大于2g 总RNA:大...
答：可参考：诱饵基因转化筛库宿主菌Y190 1） 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时(过夜)，OD600 达到1.2 左右。2） 将此3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPD 中培养4 小时左右，使 培养液OD600 达到0.6。3） 50ml 离心管收集菌液(Falcon, BD)，Eppendorf Centrifuge 5...
答：结论3：诱饵载体pBT3-STE-XXX是否存在自激活，是否可以后续筛选实验。结果显示可以进行后续筛选试验。4、酵母文库初筛 结论4：通过初筛共筛选到多少个单克隆。5、对初筛结果进行复筛 结论5：通过复筛共筛选到多少个阳性克隆。6、回转验证 结论6：对酵母阳性克隆质粒进行回转验证，确定有多少个真阳性基因。7...
答：因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。Bendixen等人通过酵母接合型的引用，避免了两次转化操作，同时又提高了双杂交的效率。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a接合型和α接合型，这两种单倍体之间接合（mating）能形成二倍体，但a接合型细胞之间或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。根据酵母...
答：可能你挑选的阳性克隆是杂菌或假阳性。建议你再重复试验一次，并做好阳性对照和阴性对照
答：1.7 DNA操作 酵母DNA的快速抽提按Robzyk和Kassir(1992)的方法。DNA操作按标准的分子克隆步骤(Sambrook等1989)。大肠杆菌的电击转化按Dower等(1988)的方法。抽提含水稻cDNA阳性质粒的双链DNA,在ABI 377型DNA自动化测序仪上进行序列测定。 引物GAL4与TAD4间的PCR扩增反应条件为:94℃ 40s, 42℃ 50s, 72℃ 3min,...
网友评论：
寇春13011045758：
谁能解释一下酵母双杂交系统的基本原理和操作流程 -
7562冀勇
： 酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统,也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法.该方法建立以来,经过不断的完善和发展,不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用,更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白.
寇春13011045758：
酵母双杂交的具体过程是什么?(中文) -
7562冀勇
： 菌株与质粒AH109酵母菌株(MATa,trp1. 901,leu2—3,112,ura3-52,his3-200,gal4A,gal8O~X, LYS2::G地1U^s-GALlT^T^-HIS3, G U^s—GAI2T^T^- ADE2,URA3::h吐1U^s.h吐1T^T^.1acZ),YM187酵母 菌株(NATQ,um3-52,his3-200,ade2—101,trpl-...
寇春13011045758：
酵母双杂文库筛选出互作蛋白,然后再怎么做 -
7562冀勇
： 然后酵母双杂交技术检测指定蛋白对之间的相互作用. 比如: 1、诱饵蛋白表达载体 2、表达载体转化酵母的验证及自激活活性,毒性检测 3、诱饵蛋白质粒与猎物蛋白质粒共转化酵母的验证以及相互作用的检测报告 4、 无相互作用时诱饵...
寇春13011045758：
酵母双杂交,bait如何构建 -
7562冀勇
： 可参考:诱饵基因转化筛库宿主菌Y190 1) 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时(过夜), OD600 达到1.2 左右. 2) 将此3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPD 中培养4 小时左右,使 培养液OD600 达到0.6...
寇春13011045758：
酵母双杂交的常见问题 -
7562冀勇
： 酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多,二是转化效率偏低.所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活.主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作...
寇春13011045758：
酵母双杂交实验有哪些注意事项 -
7562冀勇
： 如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的,该怎么办?在某些情况下,在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好.首先重悬克隆于1ml的SD/–Trp,接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板,在30℃下温浴,直至平板上的克隆相互粘在一起.用5ml 0.5X YPDA刮下每块板上的克隆,并收集到一管中,这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应.2.如果诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达,该如何处理?该蛋白很可能有转录激活域,是个转录因子.可以通过基因重组切掉转录激活域,然后重新检测其是否自激活,但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作.
寇春13011045758：
酵母双杂交系统的介绍 -
7562冀勇
： 酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域基因和转录激活因子(如GAL4等)激活结构域基因,构建成融合表达载体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统.
寇春13011045758：
如何用酵母双杂交系统探究蛋白质的功能 -
7562冀勇
： 大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报道基因, 其中之一是LacZ. 这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点, 因此可以被相同的转录激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活. 通过这种双重或多重选择既提高了检测灵...
寇春13011045758：
已知一个基因的功能和它所编码的蛋白质的氨基酸序列,如何从基因文库中调取这个基因,并利用酵母双杂交研 -
7562冀勇
： 你已经知道蛋白序列了,再找到这个基因就很容易了,根据蛋白序列找到氨基酸序列,然后设计引物就可以PCR了....
寇春13011045758：
酵母双杂交系统原理的应用 -
7562冀勇
： 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性. 主要是由于: ①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达. ②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行, 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度. ③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合, 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定. ④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大. 同时, 酵母表型, X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感.
