酵母双杂交，营养缺陷培养基长出菌落，但提质粒，没有 有关酵母双杂交系统的几个问题
\u60a8\u597d\uff0c\u9175\u6bcd\u53cc\u6742\u7b5b\u5e93\uff0c\u6d82\u5e03\u8425\u517b\u7f3a\u9677\u578b\u677f\uff0c\u6311\u53d6\u5355\u514b\u9686\u9633\u6027\u83cc\u843d\uff0c\u7528\u53cc\u7f3a\u6447\u83cc\uff0c\u63d0\u4e0d\u51fa\u8d28\u7c92\u662f\u600e\u4e48\u56de\u4e8b\uff1f\uff1f\u56e0\u4e3a\u8f6c\u8fdb\u53bb\u7684\u4e24\u4e2a\u8d28\u7c92\u4e0a\u5177\u6709\u5408\u6210\u4e24\u79cd\u6c28\u57fa\u9178\u7684\u57fa\u56e0\uff0c\u6240\u4ee5\u5728\u4e24\u7f3a\u677f\u5b50\u4e0a\u80fd\u751f\u957f\u3002\u5982\u679c\u4e24\u4e2a\u86cb\u767d\u80fd\u4e92\u4f5c\uff0c\u62a5\u544a\u57fa\u56e0\u88ab\u6fc0\u6d3b\uff0c\u6240\u4ee5\u80fd\u5728\u4e09\u7f3a\u6216\u56db\u7f3a\u677f\u5b50\u4e0a\u751f\u957f\uff0c\u5982\u679c\u4e0d\u80fd\u4e92\u4f5c\uff0c\u5c31\u4e0d\u751f\u957f\u3002
1.\u5728\u914d\u7f6e\u8425\u517b\u7f3a\u9677\u578b\u57f9\u517b\u57fa\u65f6\uff0c\u4f1a\u6709\u5927\u91cf\u7684\u6c14\u6ce1\u4ea7\u751f\uff0c\u8fd9\u662f\u4e3a\u4ec0\u4e48\uff1f
\u57f9\u517b\u57fa\u6e29\u5ea6\u592a\u4f4e,SD\u4e0d\u8981\u4ece\u51b0\u7bb1\u4e2d\u53d6\u51fa\u5c31\u7528.
\u7528\u67aa\u65f6\u5c0f\u5fc3\u6253\u51fa\u6db2\u4f53,\u67aa\u5934\u4e2d\u7559\u4e00\u70b9\u70b9\u6db2\u4f53.\u6700\u597d\u51b2\u5411\u5bb9\u5668\u58c1,\u800c\u4e0d\u662f\u76f4\u63a5\u51b2\u5411\u6db2\u4f53.
2.\u8fdb\u884c\u4e86\u4e24\u6b21\u8d28\u7c92\u8f6c\u5316\u9175\u6bcd\u5747\u4e0d\u6210\u529f\uff0c\u572830\u5ea6\u6e29\u6d74\u65f6\u9707\u8361\u4e86\uff0c\u4e0e\u8fd9\u6709\u5173\u5417\uff1f
\u9707\u8361? \u4e0a\u4e0b\u98a0\u5012\u5c31\u53ef\u4ee5. DMSO\u5bf9\u7ec6\u80de\u58c1\u6709\u7834\u574f\u4f5c\u7528.\u5267\u70c8\u632f\u8361\u7684\u8bdd,\u9175\u6bcd\u4f1a\u6b7b\u6389\u7684,\u53e6\u5916 \u8981\u9009\u7528\u8fdb\u53e3\u7684 carrier DNA, \u8d28\u7c92\u53ef\u4ee5\u591a\u52a0\u4e9b.
发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields等人建立的系统为基础的。这些新系统主要对报道基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些改进。其中一个重要改进是引入额外的报道基因，如广泛采用的HIS3基因。经过改造带有HIS3报道基因的酵母细胞，只有当HIS3被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。HIS3报道基因的转录表达是由“诱饵”和“猎物”的相互作用所启动的。大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报道基因，其中之一是 LacZ。这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点，因此可以被相同的转录激活因子（如上述的Gal4蛋白）激活。通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。其他还有针对“诱饵”或“猎物”表达载体等所作的改进，这里不一一详述。
在双杂交鉴定过程中要经过两次转化，这个工作量是相当大的，特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。而且，酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。Bendixen等人通过酵母接合型的引用，避免了两次转化操作，同时又提高了双杂交的效率。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a接合型和α接合型，这两种单倍体之间接合（mating）能形成二倍体，但a接合型细胞之间或α接合型细胞之间不能接合形成二倍体。根据酵母有性生殖的这一特点，他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞，“诱饵”表达载体转化a接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔（lawn），再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上，原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但BD融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。长出来的克隆进一步通过β-半乳糖苷酶活力进行鉴定。这项改进不仅简化了实验操作，而且也提高了双杂交的筛选效率。
我遇到的问题和您的问题一样，酵母双杂mating筛库，挑取阳性菌落摇菌，但提不出质粒，请问您是怎么解决这个问题的？！
绛旓細鍦鍙屾潅浜閴村畾杩囩▼涓缁忚繃涓ゆ杞寲锛岃繖涓伐浣滈噺鏄浉褰撳ぇ鐨勶紝鐗瑰埆鏄鎵炬柊鐨勪綔鐢ㄨ泲鐧借川鐨勬椂鍊欏挨鍏跺姝ゃ傝屼笖锛岄叺姣缁嗚優鐨勮浆鍖栨晥鐜囨瘮缁嗚弻瑕佷綆绾4涓暟閲忕骇銆傚洜姝よ浆鍖栨楠ゅ氨鎴愪负鍙屾潅浜ゆ妧鏈殑鐡堕銆侭endixen绛変汉閫氳繃閰垫瘝鎺ュ悎鍨嬬殑寮曠敤锛岄伩鍏嶄簡涓ゆ杞寲鎿嶄綔锛屽悓鏃跺張鎻愰珮浜嗗弻鏉備氦鐨勬晥鐜囥傚湪閰垫瘝鐨勬湁鎬х敓娈栬繃绋嬩腑娑夊強...
绛旓細閰垫瘝缂洪櫡鍨鍩瑰吇鍩鍘熺悊锛氶叺姣嶈弻鐨勮川绮掔瓫閫夐氬父鍩轰簬钀ュ吇缂洪櫡鍨嬬獊鍙樿弻鏍殑浣跨敤鑰屽紑灞曪紝杩欎簺鑿屾牚鍦ㄧ己涔忔煇绉嶇壒瀹氬煿鍏诲熀缁勫垎锛堟瘮濡傛皑鍩洪吀锛屽槍鍛ゆ垨鍢у暥锛夌殑鎯呭喌涓嬫棤娉曠敓闀裤傚綋杞寲鍚湁绐佸彉鍩哄洜鐨勮川绮掑悗浣垮緱闃虫ц浆鍖栧厠闅嗚兘澶熷湪缂轰箯蹇呴渶钀ュ吇缁勫垎鐨勫煿鍏诲熀鍐呯敓闀匡紝姝ｅ洜濡傛锛岀渷鍗存垚鍒嗗煿鍏诲熀娣诲姞鍓/閫夋嫨鎬ф皑鍩洪吀娣峰悎鐗╋紙DO m...
绛旓細鏄叺姣嶉仐浼犲銆佺粏鑳炰笌鍒嗗瓙鐢熺墿瀛﹀疄楠屽鐨勬渶浣抽夋嫨锛屾硾鍩鸿浜у搧椹板悕鍏ㄥ浗锛屼韩瑾変笘鐣岋紝鍏堕叺姣嶉夋嫨钀ュ吇鍩瑰吇鍩/缂虹礌鍩瑰吇鍩哄箍娉涘簲鐢ㄤ簬閰垫瘝閬椾紶銆佸熀鍥犲伐绋嬩互鍙婂伐鍏锋柟娉曞锛閰垫瘝鍙屾潅浜銆侀叺姣嶅崟鏉備氦锛夊拰鍔ㄧ墿銆佹鐗╁熀鍥犲姛鑳戒簰琛ュ疄楠岀瓑鐨勭爺绌朵腑锛屾兜鐩栭叺姣嶇爺绌剁殑涓鍒囦富瑕佹柟闈㈠拰涓鍒囦富瑕佽繃绋嬨傚垎绫诲鑸細钀ュ吇缂洪櫡鍨嬫爣璁板熀鍥犵殑...
绛旓細閰垫瘝鍙屾潅浜娉曠殑鍘熺悊锛氬吀鍨嬬殑鐪熸牳鐢熺墿杞綍鍥犲瓙锛 濡侴AL4銆丟CN4銆佺瓑閮藉惈鏈変簩涓笉鍚岀殑缁撴瀯鍩燂細 DNA缁撳悎缁撴瀯鍩(DNA-binding domain)鍜岃浆褰曟縺娲荤粨鏋勫煙(transcription-activating domain)銆傚墠鑰呭彲璇嗗埆DNA涓婄殑鐗瑰紓搴忓垪锛 骞朵娇杞綍婵娲荤粨鏋勫煙瀹氫綅浜庢墍璋冭妭鐨勫熀鍥犵殑涓婃父锛 杞綍婵娲荤粨鏋勫煙鍙悓杞綍澶嶅悎浣撶殑鍏朵粬鎴愬垎...
绛旓細1.鍦ㄩ厤缃钀ュ吇缂洪櫡鍨鍩瑰吇鍩鏃讹紝浼氭湁澶ч噺鐨勬皵娉′骇鐢燂紝杩欐槸涓轰粈涔堬紵鍩瑰吇鍩烘俯搴﹀お浣,SD涓嶈浠庡啺绠变腑鍙栧嚭灏辩敤.鐢ㄦ灙鏃跺皬蹇冩墦鍑烘恫浣,鏋ご涓暀涓鐐圭偣娑蹭綋.鏈濂藉啿鍚戝鍣ㄥ,鑰屼笉鏄洿鎺ュ啿鍚戞恫浣.2.杩涜浜嗕袱娆¤川绮掕浆鍖閰垫瘝鍧囦笉鎴愬姛锛屽湪30搴︽俯娴存椂闇囪崱浜嗭紝涓庤繖鏈夊叧鍚楋紵闇囪崱? 涓婁笅棰犲掑氨鍙互. DMSO瀵圭粏鑳炲...
绛旓細閰垫瘝鍙屾潅浜绯荤粺鐢变笁涓儴鍒嗙粍鎴愶細鈶犱笌BD铻嶅悎 鐨勮泲鐧借〃杈捐浇浣擄紝琚〃杈剧殑铔嬬櫧绉拌楗佃泲鐧斤紙bait锛夛紱鈶D铻嶅悎鐨勮泲鐧借〃杈捐浇浣擄紝鍏惰〃杈剧殑铔嬬櫧绉伴澏铔 鐧斤紙prey锛夛紱鈶㈠甫鏈変竴涓垨澶氫釜鎶ュ憡鍩哄洜鐨勫涓昏弻鏍傚父鐢ㄧ殑鎶ュ憡鍩哄洜鏈塇IS3銆乁RA3銆丩acZ鍜孉DE2绛夈傝岃弻鏍垯鍏锋湁鐩稿簲鐨钀ュ吇缂洪櫡鍨嬨傚弻鏉備氦璐ㄧ矑涓婂垎鍒甫鏈変笉鍚岀殑...
绛旓細鍥炵瓟锛氫笌棰樼洰涓嶇,浣嗗笇鏈涜兘浣滀负鍙傝 涓銆佸疄楠屽師鐞嗛叺姣嶈弻鐨勭敓娲诲彶灞炰簬鍙屽崟鎬х被鍨,瀹冧滑鐨勫崟鍊嶄綋缁嗚優鍜屼簩鍊嶄綋缁嗚優涓鑸兘鑳借繘琛屾棤闄愬埗鐨勫垎瑁傘備互鍗曞嶄綋缁嗚優涓轰富鐨勯叺姣嶈弻绉颁负鍗曞嶄綋閰垫瘝,渚嬪绮熼厭瑁傛畺閰垫瘝(Schizosaccharamycespombe)銆備互浜屽嶄綋缁嗚優涓轰富鐨勯叺姣嶈弻绉颁负浜屽嶄綋閰垫瘝,濡傚暏閰掗叺姣(鍙堢О闈㈠寘閰垫瘝,...
绛旓細缁忓煿鍏诲悗锛屾瘮杈冨墠鍚庝袱涓钩鏉夸笂闀垮嚭鐨勮弻钀姐傚鏋滃彂鐜板湪鍓嶄竴鍩瑰吇鍩骞虫澘涓婄殑鏌愪竴閮ㄤ綅闀挎湁鑿岃惤锛岃屽湪鍚庝竴骞虫澘涓婄殑鐩稿簲閮ㄤ綅鍗村憟绌虹櫧锛岃鏄庤繖灏辨槸涓涓钀ュ吇缂洪櫡鍨嬬獊鍙樻牚銆傜鍥涙锛岄壌瀹氱己闄峰瀷锛氬彲鍊熺敓闀胯氨娉曡繘琛屻傜敓闀胯氨娉曟槸鎸囧湪娣锋湁渚涜瘯鑿岀殑骞虫澘琛ㄩ潰鐐瑰姞寰噺钀ュ吇鐗╋紝瑙嗘煇钀ュ吇鐗╃殑鍛ㄥ洿鏈夊惁闀胯弻鏉ョ‘瀹氳渚...
绛旓細浠栦滑鎶婁袱涓渶瑕佷笉鍚岀敓闀垮洜瀛愮殑澶ц偁鏉嗚弻钀ュ吇缂洪櫡鍨嬫贩鍚堝煿鍏诲湪鍩烘湰鍩瑰吇鍩涓婃椂鍑虹幇浜嗛噹鐢熷瀷,鑰屽垎鍒煿鍏绘椂鍒欎粠鏈嚭鐜,浠庤岃鏄庝簡閬椾紶閲嶇粍鐨勬櫘閬嶆с1952骞,鑾卞痉浼牸鍙戠幇浜嗙粏鑿岀殑F鍥犲瓙,鎻ず浜嗕綔涓轰緵浣撶粏鑳炵殑缁嗚弻鍙互鎶婇仐浼犵墿璐ㄤ紶閫掔粰浣滀负鍙椾綋缁嗚優鐨勭粏鑿屻傝幈寰蜂集鏍肩殑涓绯诲垪鐮旂┒璇佹槑浜嗙壒瀹氱粏鑿屽彲閫氳繃鏉備氦鏂瑰紡杩涜绻佹畺,鏈夊姏鍦板弽椹...
