利用基因工程技术进行药物的研制与开发时，目的基因的鉴定方法有哪些？其原理是什么？ 在基因工程中通常需要利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞...
\u57fa\u56e0\u5de5\u7a0b\u4e2d\u76ee\u7684\u57fa\u56e0\u9274\u5b9a\u4e2d\u7684\u5206\u5b50\u6742\u4ea4\u6280\u672f\u7684\u539f\u7406\u548c\u65b9\u6cd5\uff1f\u76ee\u7684\u57fa\u56e0\u7684\u9274\u5b9a\u4e2d\u6240\u7528\u5230\u7684\u65b9\u6cd5DNA\u5206\u5b50\u6742\u4ea4\u6280\u672f\u3002\u5229\u7528\u5355\u94fe\u7684\u57fa\u56e0\u63a2\u9488\u4e0e\u76ee\u7684\u57fa\u56e0\u7ed3\u5408\u3002
\u8bfe\u672c\u4e0a\u5e76\u6ca1\u6709\u63d0\u5230\u539f\u7406\u3002\u5e94\u8be5\u662f\u78b1\u57fa\u4e92\u8865\u914d\u5bf9\u3002
\uff081\uff09\u6e29\u5ea6\u964d\u81f355\u2103\u5de6\u53f3\uff0c\u5f15\u7269\u4e0e\u6a21\u677fDNA\u5355\u94fe\u4e4b\u95f4\u9075\u5faa\u78b1\u57fa\u4e92\u8865\u914d\u5bf9\u539f\u5219\u7ed3\u5408\u5f62\u6210DNA\u6a21\u677f--\u5f15\u7269\u7ed3\u5408\u7269\uff0e\uff082\uff09\u5728PCR\u6280\u672f\u4e2d\uff0c\u5f15\u7269\u662f\u4e00\u6bb5\u77ed\u7684\u5355\u94feRNA\u6216DNA\u7247\u6bb5\uff0c\u53ef\u7ed3\u5408\u5728\u6838\u9178\u94fe\u4e0a\u4e0e\u4e4b\u4e92\u8865\u7684\u533a\u57df\uff0c\u5176\u529f\u80fd\u662f\u4f5c\u4e3a\u6838\u82f7\u9178\u805a\u5408\u4f5c\u7528\u7684\u8d77\u59cb\u70b9\uff0e\uff083\uff09\u6839\u636ePCR\u8fc7\u7a0b\u7279\u70b9\u7ed8\u5236PCR\u8fc7\u7a0b\u793a\u610f\u56fe\uff0c\u53ef\u77e5\uff0c\u4ee5\u539f\u6765\u7684\u6bcf\u6761\u6bcd\u94fe\u4e3a\u6a21\u677f\u5408\u6210\u7684\u4e24\u4e2a\u65b0DNA\u5206\u5b50\u4e2d\uff0c\u53ea\u542b\u6709\u5f15\u7269A\u6216\u5f15\u7269B\uff0c\u800c\u4ee5\u65b0\u5408\u6210\u7684\u5b50\u94fe\u4e3a\u6a21\u677f\u5408\u6210\u65b0DNA\u5206\u5b50\u65f6\uff0c\u4e24\u79cd\u5f15\u7269\u90fd\u542b\u6709\uff0c\u6545\u7b2c\u56db\u8f6e\u5faa\u73af\u5171\u4ea7\u751f8\u4e2aDNA\u5206\u5b50\uff0c\u5176\u4e2d\u542b\u6709\u5f15\u7269B\u7684\u5206\u5b50\u53ea\u67097\u4e2a\uff0c\u536078\uff0e\uff084\uff09\u7531\u56fe\u5206\u6790\u53ef\u77e5\uff1aX\u57fa\u56e0\u7b2c\u4e00\u6b21\u590d\u5236\u5f97\u5230\u4e24\u4e2a\u4e24\u79cd\uff1a\u2460\u548c\u2461\uff1bX\u57fa\u56e0\u7b2c\u4e8c\u6b21\u590d\u5236\u5f97\u5230\u56db\u4e2a\u56db\u79cd\uff1a\u2460\u590d\u5236\u5f97\u2460\u548c\u2462\u3001\u2461\u590d\u5236\u5f97\u2461\u548c\u2463\uff1bX\u57fa\u56e0\u7b2c\u4e09\u6b21\u590d\u5236\u5f97\u5230\u516b\u4e2a\u4e94\u79cd\uff1a\u2460\u590d\u5236\u5f97\u2460\u548c\u2462\u3001\u2462\u590d\u5236\u5f97\u2462\u548c\u2464\u3001\u2461\u590d\u5236\u5f97\u2461\u548c\u2463\u3001\u2463\u590d\u5236\u5f97\u2463\u548c\u2464\uff1bX\u57fa\u56e0\u7b2c\u56db\u6b21\u590d\u5236\u5f97\u523016\u4e2a\u4e94\u79cd\uff1a\u2460\u590d\u5236\u5f97\u2460\u548c\u2462\u3001\u4e24\u4e2a\u2462\u590d\u5236\u5f97\u4e24\u4e2a\u2462\u548c\u4e24\u4e2a\u2464\u3001\u4e24\u4e2a\u2463\u590d\u5236\u5f97\u4e24\u4e2a\u2463\u548c\u4e24\u4e2a\u2464\uff0e\u4e24\u4e2a\u2464\u5f97\u52304\u4e2a\u2464\uff0e \u4ece\u4e0a\u9762\u7684\u63a8\u6d4b\u53ef\u77e5\uff0c\u7b2c\u4e09\u8f6e\u5faa\u73af\u4ea7\u7269\u4e2d\u624d\u80fd\u5f00\u59cb\u51fa\u73b0\u72ec\u7acb\u4e14\u5b8c\u6574\u7684X\u57fa\u56e0\uff0c\u5373\u2464\uff0e\u5982\u679c\u7ecf\u8fc7n\u6b21\u5faa\u73af\uff0c\u5219\u4ea7\u7269\u4e2d\u2460\u6240\u793aDNA\u5206\u5b50\u6570\u4e3a1\u4e2a\uff0e\uff085\uff09\u5355\u72ec\u7528EcoRV\u53ef\u5c06\u8d28\u7c92\u5207\u6210\u4e00\u6bb5\uff0c\u8bf4\u660e\u5728\u5176\u4e0a\u6709\u4e00\u4e2aEcoRV\u5207\u70b9\uff0e\u5355\u72ec\u4f7f\u7528MboI\u80fd\u5c06\u73af\u72b6\u8d28\u7c92\u5207\u62102.5kb\u548c11.5kb\u4e24\u6bb5\uff0c\u8bf4\u660e\u5728\u8d28\u7c92\u7ae0\u6709\u4e24\u4e2aMboI\u5207\u70b9\uff0c\u4e14\u5207\u70b9\u57282.5kb\u548c11.5kb\u4e4b\u95f4\uff0e\u4e24\u8005\u5171\u540c\u4f7f\u7528\u65f6\uff0c\u73af\u72b6\u8d28\u7c92\u88ab\u5207\u6210\u4e09\u6bb5\uff0c\u8bf4\u660e\u5728\u8d28\u7c92\u4e0a\u5171\u6709\u4e09\u4e2a\u5207\u70b9\uff0c\u8bf4\u660eEcoRV\u7684\u5207\u70b9\u57285.5kb\u548c6kb\u4e4b\u95f4\uff0e\u5982\u56fe\u6240\u793a\uff1a\u6545\u7b54\u6848\u4e3a\uff1a\uff081\uff09\u78b1\u57fa\u4e92\u8865\u914d\u5bf9\uff082\uff09\u80fd\u4e0e\u6a21\u677f\u94fe\u78b1\u57fa\u4e92\u8865\u914d\u5bf9\uff0c\u5f15\u5bfc\u5e76\u4f5c\u4e3a\u5b50\u94fe\u5408\u6210\u7684\u8d77\u70b9\uff083\uff097/8\uff084\uff093 1\uff085\uff09
目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体（recombinant）。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选(dcreening)是基因克隆的重要步骤。在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。以下就常用技术的基本原理加以介绍。一、根据重组载体的标志作筛选
最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。
载体含有lacZ’的蓝白筛选法，近年更被广泛应用。例如将目的序列插入前面述及的质粒pUC19的多克隆位点，转化大肠杆菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养，凡能生长并呈白色的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒，这样就很容易获得目的序列的克隆。
根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步细致的筛选。
二、核酸杂交法
利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影（auroradiography）法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。
三、PCR法
PCR技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增，若能得到预期长度的PCR产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列。
四、免疫学方
利用特定抗体与目的基因表达产物特异性结合的作用进行筛选。此法不是直接筛选目的基因，而是通过与基因表达产物的反应指示含有目的基因的转化细胞，因而要求实验设计要使目的基因进入受体细胞后能够表达出其编码产物。抗体可用特定的酶常用过氧化物酶、碱性磷酸酶等标记，结合酶标抗体处，酶可催化特定的底物分解而呈现颜色，从而指示出含有目的的基因的细胞集落位置。免疫学方法特异性强、灵敏度高，适用于从大量转化细胞集合体中筛选很少几个含目的基因的细胞克隆。
五、DNA限制性内切酶图谱分析
这是在上述筛选后的进一步分析。目的序列插入载体会使载体DNA限制性酶图谱（restriction map）发生变化，例如一个长600bp的目的序列利用它两端的EooR I和SalI切后的粘末端连接插入pUC19的多克隆点，则重组质粒就增大为3.3kb，用Eoor I和SalI双酶切后会出现600bp和-2.7kb两个DNA片段，提取转化细菌的质粒DNA作酶切后做电泳观察其酶切图谱，就能分析得结果；如插入的目的序列中有其它限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观察到。这就可以进一步鉴定重组体是不是所要的目的克隆。
六、核苷酸序列测定
所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列测定来最后鉴定。已知序列的核酸克隆要经序列测定确证所获得的克隆准确无误；未知序列的核酸克隆要测定序列才能确知其结构、推测其功能，用进一步的研究。因此核酸序列测定是分子克隆中必不可少的鉴定步骤。核酸序列测定的原理和方法在实验教材中有详细的叙述。
PCR基因扩增，然后电泳跑胶。然后和已知的标准作对比。我们实验室一般采用的方法。
原理么？你应该对生物工程了解一点，自己去查查看吧！
PCR --电泳---标准作对比 0k
绛旓細鏍搁吀鎺㈤拡鍙互鐢鏀惧皠鎬ф牳绱犳爣璁帮紝缁撳悎浜嗘斁灏勬ф牳閰告帰閽堢殑鑿岃惤闆嗗洟鍙敤鏀惧皠鎬ц嚜鏄惧奖锛坅uroradiography锛夋硶鎸囩ず鍑烘潵锛屾牳閰告帰閽堜篃鍙互鐢ㄩ潪鏀惧皠鎬х墿璐ㄦ爣璁帮紝閫氬父鏄粡棰滆壊鍛堢幇鎸囩ず浣嶇疆锛岃繖鏍峰氨鍙互灏嗗惈鏈夌洰鐨勫簭鍒楃殑鑿岃惤鎸戦夊嚭鏉ャ備笁銆丳CR娉 PCR鎶鏈殑鍑虹幇缁欏厠闅嗙殑绛涢夊鍔犱簡涓涓柊鎵嬫銆傚鏋滃凡鐭ョ洰鐨勫簭鍒楃殑闀垮害鍜屼袱绔殑...
绛旓細銆愮瓟妗堛戯細鍒╃敤鍩哄洜宸ョ▼鎶鏈寮鍙戠殑鐢熺墿鑽墿鐨杩囩▼鐨4涓富瑕佹楠ゆ槸锛氣憼宸ヤ綔缁嗚優搴撶殑寤虹珛锛氬寘鎷厠闅嗙洰鐨勫熀鍥犮佹瀯寤鸿〃杈捐浇浣撱佽浆鍖栧涓荤粏鑳炪佺瓫閫夎浆鍖栦釜浣撶瓑锛涒憽涓婃父鍔犲伐杩囩▼锛氬宸ヤ綔缁嗚優搴撶殑缁嗚優杩涜澶ц妯＄殑澧炴畺锛岃幏寰楃敓鐗╄嵂鐗╁垵浜у搧锛涒憿涓嬫父鍔犲伐杩囩▼锛氬埄鐢ㄦ矇娣銆佽秴婊ゅ拰灞傛瀽绛夌函鍖栨妧鏈幏寰楁渶缁堜骇鍝侊紱鈶ｇ粓浜у搧鐨...
绛旓細銆愮瓟妗堛戯細鐢ㄥ熀鍥犲伐绋鏂规硶鍒堕犵殑宸ョ▼鑿屽彲浠ラ珮鏁堢巼鍦颁骇鐢熷悇绉嶉珮璐ㄩ噺銆佷綆鎴愭湰鐨鑽搧銆杩涜鍩哄洜鎿嶄綔涓鑸鍥涗釜鎶鏈閫斿緞銆備竴銆佹彁鍙栫洰鐨勫熀鍥狅紝鏈変袱鏉￠斿緞锛氫竴鏄粠渚涗綋缁嗚優鐨凞NA涓洿鎺ュ垎绂伙紱浜屾槸浜哄伐鍚堟垚銆備簩銆佺洰鐨勫熀鍥犱笌杩愯浇浣撶粨鍚堛傝川绮掓槸鏈甯哥敤鐨勮繍杞戒綋锛屾墍浠ヨ繖涓姝ヤ篃鍙噸缁勮川绮掋備笁銆佸皢鐩殑鍩哄洜瀵煎叆鍙椾綋缁嗚優銆
绛旓細鍩哄洜宸ョ▼鑽墿鍒堕犵殑涓鑸祦绋:(1)鑾峰緱鐩殑鍩哄洜;(2) 缁勫缓閲嶇粍璐ㄧ矑;(3)鏋勫缓鍩哄洜宸ョ▼鑿;(4)鍩瑰吇宸ョ▼鑿;(5)浜х墿鍒嗙绾寲;(6)闄よ弻杩囨护;(7)鍗婃垚鍝佹瀹;(8)鍖呰 1,涓婃父闃舵:棣栧厛鑾峰緱鐩殑鍩哄洜,鐒跺悗鐢闄愬埗鎬у唴鍒囬叾鍜岃繛鎺ラ叾灏嗗叾鎻掑叆閫傚綋鐨勮浇浣撹川绮掓垨鍣弻浣撲腑骞惰浆澶ц偁鏉嗚弻鎴栧叾瀹冨涓昏弻(缁嗚優),浠ヤ究澶ч噺澶嶅埗鐩...
绛旓細鍩哄洜宸ョ▼鑽墿鐨鐢熶骇蹇呴』棣栧厛鑾峰緱鐩殑鍩哄洜锛岀劧鍚鐢闄愬埗鎬у唴鍒囬叾鍜岃繛鎺ラ叾灏嗘墍闇鐩殑鍩哄洜鎻掑叆閫傚綋鐨勮浇浣撹川绮掓垨鍣弻浣撲腑骞惰浆鍏ュぇ鑲犳潌鑿屾垨鍏朵粬瀹夸富鑿岋紙缁嗚優锛夛紝浠ヤ究澶ч噺澶嶅埗鐩殑鍩哄洜銆傚鐩殑鍩哄洜瑕杩涜闄愬埗鎬у唴鍒囬叾鍜屾牳鑻烽吀搴忓垪鍒嗘瀽銆傜洰鐨勫熀鍥犺幏寰楀悗锛屾渶閲嶈鐨勫氨鏄娇鐩殑鍩哄洜琛ㄨ揪銆傚熀鍥犵殑琛ㄨ揪绯荤粺鏈夊師鏍哥敓鐗╃郴缁熷拰鐪熸牳...
绛旓細銆愮瓟妗堛戯細鐢熺墿鎶鏈簲鐢ㄤ簬鍒惰嵂宸ヤ笟鍙ぇ閲忕敓浜у粔浠风殑闃叉不浜虹被閲嶅ぇ鐤剧梾鍙婄枒闅剧棁鐨勬柊鍨鑽墿锛屽叿浣撲綋鐜板湪浠ヤ笅鍑犱釜鏂归潰锛(1)鍩哄洜宸ョ▼鍒惰嵂锛鍒╃敤鍩哄洜宸ョ▼鎶鏈鍙敓浜у嚭鍏锋湁鐢熺悊娲绘х殑鑲界被鍜岃泲鐧借川 绫昏嵂鐗╋紝鍩哄洜宸ョ▼鐤嫍鍜屾姉浣擄紝杩樺彲寤虹珛鏇存湁鏁堢殑鑽墿绛涢夋ā鍨嬶紝鏀硅壇鐜版湁鍙 閰佃弻绉嶏紝鏀硅繘鐢熶骇宸ヨ壓锛屾彁渚涙洿鍑嗙‘鐨勮瘖鏂妧鏈...
绛旓細鍒╃敤鍩哄洜宸ョ▼鎶鏈寮鍙戞柊鍨嬫不鐤鑽墿鏄綋鍓嶆渶娲昏穬鍜屽彂灞曟渶蹇殑棰嗗煙銆傚熀鍥犲伐绋嬭嵂鐗╄嚜1982骞撮棶涓栦互鏉ワ紝鎴愪负鍒惰嵂琛屼笟鐨勪竴鏀鍏碉紝姣忓勾骞冲潎鏈3-4涓柊鑽垨鐤嫍闂笘锛屽紑鍙戞垚鍔熺害浜斿崄涓鑽搧宸插箍娉涘簲鐢ㄤ簬娌荤枟鐧岀棁銆佽倽鐐庛佸彂鑲蹭笉鑹佺硸灏跨梾銆佸泭绾ょ淮鍙樻у拰涓浜涢仐浼犵梾涓婏紝鍦ㄥ緢澶氶鍩熺壒鍒槸鐤戦毦鐥呯棁涓婏紝璧峰埌浜嗕紶缁熷寲瀛﹁嵂鐗...
绛旓細鐩墠鍩哄洜宸ョ▼鍒惰嵂涓嶅ぇ鏅皵锛屼竴涓伐鍘傚氨澶熶竴涓浗瀹鐢ㄧ殑浜嗭紝绔炰簤澶縺鐑堛傚叿浣撳彲浠ョ湅涔︺
绛旓細1銆侀珮鏁堟柟闈鍩哄洜宸ョ▼鎶鏈鍙互閫氳繃閲嶇粍DNA鎶鏈紝灏嗙洰鏍囧熀鍥犳彃鍏ュ埌寰敓鐗╂垨妞嶇墿缁嗚優涓紝浣垮叾浜х敓鐗瑰畾鐨勮嵂鐗┿傜浉姣斾紶缁熻嵂鐗╃敓浜ф柟娉曪紝鍩哄洜宸ョ▼鎶鏈兘澶熸洿楂樻晥鍦扮敓浜уぇ閲忕殑鑽墿锛屾彁楂樼敓浜ф晥鐜囷紝鍏锋湁楂樻晥鎬с2銆佺簿纭柟闈傚熀鍥犲伐绋嬫妧鏈彲浠ョ簿纭湴瀹氬埗鍜岃皟鏁鑽墿鐨鍚堟垚杩囩▼銆閫氳繃鍩哄洜缂栬緫鍜屽熀鍥犺〃杈捐皟鎺х瓑鎶鏈墜娈碉紝...
绛旓細鎶戝埗鑲跨槫缁嗚優澧炵敓锛岃皟鑺備汉浣撳厤鐤姛鑳界殑浣滅敤锛屽箍娉涚敤浜庣梾姣掓х柧鐥呮不鐤楀拰澶氱鑲跨槫鐨勬不鐤楋紝鏄綋鍓嶅浗闄呭叕璁ょ殑鐥呮瘨鎬х柧鐥呮不鐤楃殑棣栭鑽墿鍜岃偪鐦ょ敓鐗╂不鐤楃殑涓昏鑽墿銆傗懚鍏跺畠鍩哄洜宸ョ▼鑽墿 浜洪犺娑层佺櫧缁嗚優浠嬬礌銆佷箼鑲濈柅鑻楃瓑閫氳繃鍩哄洜宸ョ▼瀹炵幇宸ヤ笟鍖栫敓浜э紝鍧囦负瑙ｉ櫎浜虹被鐨勭梾鑻︼紝鎻愰珮浜虹被鐨勫仴搴锋按骞冲彂鎸ヤ簡閲嶅ぇ鐨勪綔鐢ㄣ
