ChIP-Seq分析之ChIPQC结果含义
示例结果可以看： https://www.dropbox.com/s/sn8drmjj2tar4xs/ChIPQCreport - full dataset.zip?dl=1
首先映入眼帘的是总体报告：
其中有一些指标见过，一些没见过，像是SSD, RiP and RiBL这几列就是ENCODE计划提出的指标。就是评估了信号的分布，在富集区域、整个基因组、已知的artefact regions
总而言之，这些全部的指标可以分为4类：
切记：通过这些指标也不意味着实验就是成功的，相反亦然
包括了：read depth, read length, duplication rate
如果read depth, read length在样本间差异很大，就要引起注意了
由于之前已经过滤掉了重复reads，所以这里的duplication rate没什么用
包括了RiP, SSD, and RiBL
也叫FRiP，表示：the percentage of reads that overlap ‘called peaks’，也就是peaks包含的reads数占reads总数的百分比
可以理解成：信噪比（signal-to-noise）
根据感兴趣蛋白（POI，protein of interest）的不同，RiP值也差异较大：
上面图中看到，Nanog比Pou5f1的RiP值要高，而Pou5f1-rep2更是低的可怜，可以说明的是：Nanog样本富集效果更好
有两张图可以反映：
不过看箱线图发现，虽然Nanog的RiP较高，但这个分布和Pou5f1也相差太远，推测可能与read length 、 depth有关
表示基因组中信号值的标准差，可以反映reads在基因组中覆盖度一致性，越大越离散，就是高的越高，低的越低
我们希望看到：IP样本中这个值较大，说明富集区域信号很强 ，非富集区域信号较弱，因此它的标准差很大；而control样本最好就是标准差较小，不要有太大的波动
SSD值高虽然说明有的区域信号强，但不一定是ChIP的富集区域，一些blacklist区域也会存在较强的信号
【关于blacklist：】
我们这里的数据显示：Pou5f1比Nanog的SSD值要高，可能说明Pou5f1的富集效果更好，但不能确定，因为还需要确定Pou5f1的SSD高不是由于未知的artifact造成
有一张图可以反映：Coverage histogram
好的富集结果一般是：有一条尾巴（依然存在很多位点具有较高的测序深度）；而像input样本这种低富集的，主要是包含背景，因此它的y轴很高，同时x轴很低
我们这个数据集中，尤其是 Nanog rep2样本，具有更粗壮的尾巴（Heavy tail，意思就是在曲线以下具有更大的空间） 。Nanog样本具有更多高深度的位点
综合考量：
Pou5f1的coverage不如Nanog，但SSD高于Nanog。说明Pou5f1存在某一块区域深度较高，但不是整体都高，可能存在blacklist区域
那么是否真的存在blacklist区域呢？还有再看一个指标：
也就是与已知blacklist有交集的reads占比。这个值越低越好
黑名单区域一般也是唯一比对，因此常规的去重复操作对它无效。这些区域一般是：着丝粒，端粒和卫星重复序列
黑名单区域的危害是：confound peak callers and fragment length estimation，因此需要追踪并去除比对到这些区域的reads
我们的数据中，RiBL的比例看上去还比较合理，并没有出奇的高。因此高SSD可能是因为存在更多容易破碎的开放染色质区域，或者存在hyper-ChIPable区域，与很多不相干的蛋白也能产生富集，导致假阳性
当然，如果 在peak calling之前去掉了黑名单区域，就没必须分析RiBL了
主要包括：FragLength and RelCC（又称Relative strand cross-correlation coefficient or RSC）
一般，RelCC在所有的ChIP样本中大于1，表示具有较高的信噪比；FragLength也应该与文库制备过程中设定的片段长度接近
一个高质量的ChIP实验，会在POI附近形成非常显著的reads富集，会在正负链发现双峰分布
Cross-Correlation scores的计算：Pearson’s linear correlation between coverage for each complementary base. These Pearson correlation values are computed for every peak for each chromosome and values are multiplied by a scaling factor and then summed across all chromosomes，就是先在正负链生成两个向量，表示某个碱基位点的reads数量，然后求这两个向量的相关性，并逐渐沿着shift size移动，最后得到一个相关性表
最后这个cross-correlation值算好，就会画在y轴上，x轴就表示shift size
<img src="https://jieandze1314-1255603621.cos.ap-guangzhou.myqcloud.com/blog/2020-06-20-120928.png" alt="image-20200620200928712" />
一般这个cross-correlation plot会产生两个峰：
我们这里的数据中，Nanog 和 Pou5f1都能看到两个峰：
它就是根据cross-correlation的最大、最小值计算的
RSC值低可能是由于ChIP的质量差、测序reads质量差导致错配多、测序深度不够【其实可以理解为：RSC值低=》就是相关性计算的值低=》正负链没有足够的reads =》 也就是上述原因】
另外，数据集的结合位点太少（比如小于200）也会导致低的RSC【这个也很好理解，结合位点少，更别提位点正负链富集的reads数量了】。结合位点少的原因可能是生物因素（比如某一个因子在某一个特定组织中就这么几个位点）
Cross-Correlation Plots的例子
强信号：
下面这个例子是人类细胞的CTCF 转录因子(zinc-finger transcription factor)。使用一个好的抗体，转录因子一般会富集45,000 - 60,000个peaks。红线表示真正的peak，蓝色线表示read length
弱信号：
抗体不是特别有效，得到的峰也比较分散，在185-200bp间存在真的峰，另一个蓝色则是read length。对于弱信号的数据，read-length peak将占据主导地位
没有信号：
表示实验失败或者input样本，基本看不到fragment length这个峰
也就是在特定的结合位点附近，没有富集到reads
将peaks与基因组注释结合起来，看看reads主要富集在哪些区域
我们的数据中，“Promoters500” and “All5UTRs”的富集程度最高，也符合预期（Nanog和Pou5f1作为转录因子应该结合在这块区域）
这个形状根据抗体的类型存在差异：transcription factor, histone mark, or other DNA-binding protein such as a polymerase
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绛旓細Brind'Amour J, Liu S, Hudson M, Chen C, Karimi MM, Lorincz MC. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 2015 Jan 21;6:6033. doi: 10.1038/ncomms7033. PMID: 25607992.Matthew Lorincz瀹為獙瀹2015骞村彂琛ㄧ殑閫傜敤浜...
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