酵母双杂交ad载体
答：最近在做龙须菜高温胁迫表达cDNA文库的构建，选择的是CaM做诱饵质粒构建表达载体pGBKT-CaM，利用SMART技术将重组质粒转化到酵母菌Y187中，搜集了部分资料找到了一份比较全的酵母双杂交实验操作步骤。一.酵母双杂交系统的原理 酵母的转录激活因子GAL4由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成，N...
答：AD载体一般没有核定位信号，BD有 但是质膜蛋白的互作可能依赖翻译后修饰，所以两个蛋白都入核也不一定能互作，即使自然条件下它们是互作的
答：酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质分别克隆（融合)到酵母表达质粒的转录激活域(如GAL4等)的DNA结合结构域(DNA-BD)和转录激活域(AD)上，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子。蓝白斑筛选主要为基因互补与...
答：酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。所谓假阳性就是：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用，或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合，则也可单独激活报告...
答：扩增诱饵基因：使用PCR等方法从适当的模板（例如基因组DNA或cDNA）扩增出诱饵基因的DNA序列。酵母双杂 克隆诱饵基因到诱饵载体中：将扩增得到的诱饵基因插入到酵母双杂交诱饵载体中。常用的载体包括pGBKT7（Gal4系统）或pLexA（LexA系统）。这些载体通常包含启动子、标签和选择标记等功能。验证构建的诱饵载体...
答：膜体系酵母双杂交载体选择攻略 膜体系酵母双杂选择载体是根据诱饵蛋白质定位的不同来选择，有利于互作蛋白相连的泛素NubG和Cub-LexA-VP16相互作用，被UBPs识别，从而启动下游报告基因表达。那么膜体系有哪些载体？具体要如何选择？下面小正给您支支招。1、膜体系有哪些诱饵载体？膜体系酵母双杂交有三种诱饵...
答：注意事项 （1）酵母双杂交对照的设定 常规的酵母双杂交操作时一般会设定阳性对照、阴性对照以及显色系统对照三种对照，以MATCHMAKER GAL4酵母双杂交筛选系统为例：阳性对照：pGADT7-T + pGBKT7-53，其中T蛋白和53蛋白是已经明确在酵母细胞内能够发生结合并启动报告基因表达的两种蛋白。阴性对照：pGADT7-...
答：Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型，将前者与Gal4的BD结构域融合，另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合由BD和AD形成的融合蛋白一般分别称之为“诱饵”（bait）和“猎物”或靶蛋白（prey or target protein）。如果在Snf1和Snf2之间...
答：6.cDNA与酵母双杂交文库载体(pGADT7或者pDEST22)进行all-direct重组 7.重组产物电转化 8.文库检测以及质粒提取 3.1 All-direct方法与SMART方法的比较与优势 3.2 All-direct方法与Gateway方法的比较与优势 25个工作日内,如需转化酵母延长15个工作日。 备注1:该酵母文库可以选择增加均一化处理步骤,我们使用DSN法...
网友评论：
昌届14794613210：
酵母双杂交可用于报道基因的种类有哪些?产物有哪些 -
47076时叔
： 酵母双杂交系统由 Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立 i .典型的真核生长转录因子, 如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain...
昌届14794613210：
酵母双杂交的常见问题 -
47076时叔
： 酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多,二是转化效率偏低.所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活.主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作...
昌届14794613210：
酵母双杂交系统有哪些优缺点 -
47076时叔
： 1、高敏感性.原因:①采用高拷贝和强启动子的表达载体,使融合蛋白过量表达;②激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物,之后又与启动子结合,此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定;③通过mRNA使信号放大;④检测的结果是基因表达产物的累积效应,可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用.2、真实性.检测在活细胞内进行,作用条件与作用力无需模拟,在一定程度上代表细胞内的真实情况.3、简洁性.融合蛋白相互作用后,减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤. 3、广泛性.采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库,能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质,适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白.
昌届14794613210：
酵母双杂交系统的介绍 -
47076时叔
： 酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域基因和转录激活因子(如GAL4等)激活结构域基因,构建成融合表达载体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统.
昌届14794613210：
如何用酵母双杂交系统探究蛋白质的功能 -
47076时叔
： 大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报道基因, 其中之一是LacZ. 这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点, 因此可以被相同的转录激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活. 通过这种双重或多重选择既提高了检测灵...
昌届14794613210：
酵母双杂交 - 酵母双杂交两种菌杂交效率不高有哪些原因?
47076时叔
： 酵母双杂交技术研究进展 张迪 霍克克 顾科隆 赵翔 李育阳 提 要 酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法,在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取...
昌届14794613210：
酵母双杂交系统是利用了真核生物转录因子的哪些结构特点 -
47076时叔
： 主要是利用了两个特点:(1)转录因子具有DNA结合结构域,即BD;(2)转录因子具有转录激活结构域,即AD.
昌届14794613210：
DNA结构域BD与AD是同一蛋白的两部分吗? -
47076时叔
： 是的,以酵母双杂交系统为例该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识.真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与,真核生长转录因子含有两个不同的结构域: DNA结合结构域(BD)(DNA binding domain) 转录激活...
昌届14794613210：
酵母双杂交系统原理的应用 -
47076时叔
： 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性. 主要是由于: ①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达. ②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行, 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度. ③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合, 此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定. ④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大. 同时, 酵母表型, X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感.
